AM1241抑制ADPβS诱发的培养的大鼠脊髓背角小胶质细胞P2Y12/P2Y13受体及炎症因子表达与释放的研究

摘要

神经病理性疼痛（Neuropathic Pain, NP）一般发生于神经损伤或某些疾病如癌症、糖尿病、感染、自身免疫性疾病和创伤之后。在病理性疼痛过程中，内源性大麻素CB2 受体（cannabinoid receptor 2，CB2R）激活，调节脊髓背角小胶质细胞功能，发挥抗痛觉过敏效应。现有证据表明，AM1241，作为一种特异性CB2受体激动剂，具有抑制伤害性反应及缓解神经痛和炎症性疼痛的作用；在脊神经结扎（spinal nerve ligation，SNL）大鼠、坐骨神经缩窄性损伤（chronic constriction injury，CCI）大鼠、骨癌痛（bone cancer pain，BCP）小鼠等神经病理性疼痛模型中，AM1241均能明显缓解痛敏症状[1-3]。另外，在坐骨神经分支选择性损伤(spared nerve injury，SNI)大鼠和CCI大鼠，脊髓背角小胶质细胞P2Y12和P2Y13受体表达上调，提示P2Y12和P2Y13受体参与了外周神经损伤后的疼痛症状[4-6]。在CCI大鼠，鞘内注射CB2受体激动剂AM1241可以抑制脊髓背角P2Y12和P2Y13受体表达[7, 8]。然而，在离体条件下，AM1241是否可以抑制背角小胶质细胞P2Y12和P2Y13受体表达上调，有待进一步验证。因此，本实验离体培养SD乳鼠（＜3d）脊髓背角小胶质细胞，综合应用形态学、分子生物学方法，观察：（1）AM1241对ADPβS诱发的脊髓背角小胶质细胞Iba-1（ionized binding calcium adapter molecule-1 ，钙离子接头分子-1 ）、P2Y12/P2Y13受体、IL-1β（interleukin-1β，白介素-1β）、IL-6（interleukin-6，白介素-6）和TNF-α（tumour necrosis factor-α，肿瘤坏死因子-α）mRNA表达的影响。（2）AM1241对ADPβS刺激的脊髓背角小胶质细胞IL-1β、IL-6和TNF-α释放以及钙动员的影响。 目的： 明确AM1241是否影响ADPβS诱发的脊髓背角小胶质细胞P2Y12和P2Y13受体表达及炎症因子表达或释放。 方法： 1. 培养并纯化SD乳鼠（＜3d）脊髓背角小胶质细胞，接种于12孔板（5×105/孔）培养48h。实验分组：（1）空白对照组，加入单纯DMEM/HG培养基；（2）ADPβS处理组，加入ADPβS（10-5 mol/L），作用3h；（3）AM1241处理组，AM1241分别不同浓度（10-7、10-6、10-5 mol/L）预处理1h，加入ADPβS（10-5 mol/L），作用3h；（4）AM630+AM1241处理组，AM630分别不同浓度（10-7、10-6、10-5 mol/L）预处理1h，加入AM1241（10-5 mol/L），处理1h，最后加入ADPβS（10-5 mol/L），作用3h。RTFQ-PCR检测背角小胶质细胞Iba-1、P2Y12/P2Y13受体mRNA表达。 2. 培养并纯化SD乳鼠（＜3d）脊髓背角小胶质细胞，接种于12孔板（5×105/孔），培养48h。实验分组：（1）空白对照组，加入单纯DMEM/HG培养基；（2）ADPβS处理组，加入ADPβS（10-5 mol/L），作用3h；（3）AM1241处理组，AM1241（10-5 mol/L）预处理1h，加入ADPβS（10-5 mol/L），作用3h；（4）AM630+AM1241处理组，AM630（10-5 mol/L）预处理1h，加入AM1241（10-5 mol/L），处理1h，最后加入 ADPβS（10-5 mol/L），作用 3h。RTFQ-PCR 检测背角小胶质细胞 IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA水平表达；ELISA技术检测IL-1β、IL-6和TNF-α 释放。 3. 培养并纯化新生SD乳鼠（＜3d）脊髓背角小胶质细胞，接种在盖玻片上，Fluo-4 AM（5 μmol /L)荧光负载。实验分组：（1）空白对照组；（2）ADPβS处理组，加入ADPβS（10-5 mol/L）；（3）MRS2211组，MRS2211（10-5 mol/L）预处理20min加入ADPβS（10-5 mol/L）；（4）AM1241处理组，AM1241（10-5 mol/L）预处理10min加入ADPβS（10-5 mol/L）。以F1/F0表示相对荧光强度变化并进行统计。 结果： 1. ADPβS（10-5 mol/L）处理3 h后，Iba-1、P2Y12和P2Y13 受体mRNA表达明显上调，与空白对照组相比，具有统计学意义（P<0.05）；AM1241（10-7、10-6、10-5 mol/L）不影响 ADPβS 诱发的背角小胶质细胞 Iba-1mRNA 表达上调的效应。10-7 mol/L 的AM1241微弱抑制ADPβS诱发的小胶质细胞P2Y12和P2Y13 受体mRNA表达上调，无统计学意义；AM1241 浓度为 10-6和 10-5 mol/L可明显抑制 ADPβS 诱发的P2Y12和 P2Y13受体 mRNA 表达上调，与 ADPβS 组相比，具有统计学意义（P<0.05）， AM1241浓度为10-5 mol/L时几乎全部阻断ADPβS诱发的背角小胶质细胞P2Y12和P2Y13受体在mRNA水平表达上调（P<0.05）。与AM1241处理组相比，AM630浓度为10-7 mol/L不能反转AM1241（10-5 mol/L）的抑制效应；但AM630浓度为10-6和10-5 mol/L均可明显反转AM1241（10-5 mol/L）的抑制效应（P<0.05），当AM630浓度为10-5 mol/L几乎完全反转AM1241（10-5 mol/L）的抑制效应（P<0.05）。 2. 与空白对照组相比，ADPβS（10-5 mol/L，3h）诱发背角小胶质细胞IL-1β、IL-6 和TNF-αmRNA表达上调，具有统计学意义（P<0.05）；AM1241（10-5 mol/L，1h）明显抑制ADPβS诱发的小胶质细胞IL-1β、IL-6 和TNF-αmRNA表达上调，与ADPβS组相比，具有统计学意义（P<0.05）；与AM1241处理组相比，AM630（10-5 mol/L， 1h）几乎全部阻断AM1241的抑制效应，具有统计学意义（P<0.05）。 3. 与空白对照组相比，ADPβS（10-5 mol/L，3h）诱发背角小胶质细胞IL-1β、IL-6 和TNF-α释放明显增多，具有统计学意义（P <0.05）；AM1241（10-5 mol/L，1h）预先孵育可明显抑制ADPβS诱发的IL-1β、IL-6 和TNF-α释放增加，与ADPβS组相比，具有统计学意义（P<0.05）；与AM1241处理组相比，AM630（10-5 mol/L，1h）几乎全部阻断AM1241的抑制效应，具有统计学意义（P<0.05）。 4.与静息状态相比，ADPβS（10-5 mol/L）促进培养的脊髓背角小胶质细胞[Ca2+]i快速增高（P <0.05）；ADPβS 诱发的钙动员可以被 MRS2211（10-5 mol/L）所阻断（P<0.05），但不能被AM1241（10-5 mol/L）所阻断。 结论： 1. AM1241可以抑制ADPβS诱发的脊髓背角小胶质细胞P2Y12和P2Y13受体mRNA表达上调和后续的炎症因子表达及释放。 2. AM1241不影响ADPβS诱发的脊髓背角小胶质细胞Iba-1mRNA表达上调和小胶质细胞[Ca2+]i的增高。

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