E3泛素连接酶TRIM4和TRIM21调节细胞抗病毒天然免疫信号转导的机制

摘要

细胞抗病毒天然免疫反应是细胞抵御病毒感染的第一道防线。病毒感染细胞以后，细胞内模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）通过识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)激活下游信号通路，诱导Ⅱ型干扰素和炎症细胞因子的表达，从而启动整个天然免疫应答。 病毒在感染与复制的过程中，病毒的许多保守组分，比如病毒的dsRNA，会被细胞的PRRs如RIG-Ⅰ样受体(RIG-Ⅰlike receptors，RLRs)识别。RLRs在识别病毒dsRNA以后，招募其下游接头蛋白VISA。VISA一方面通过与TRAF3，MITA和TBKI结合形成复合物，从而激活转录因子IRF3;另一方面，VISA通过对TRAF2/6的招募驱动IKK复合物激活另一个转录因子NF-κB。活化后的IRF3和NF-κB进入细胞核，共同作用启动Ⅱ型干扰素的表达。 蛋白修饰在机体调控细胞抗病毒天然免疫反应过程中起着十分重要的作用，泛素化与去泛素化修饰是多种蛋白修饰中较为重要的调控方式。为了寻找新的参与调控细胞抗病毒天然免疫反应的蛋白，我们通过报告基因实验筛选了352个泛素相关单克隆文库，我们发现，E3泛素连接酶TRIM4在过量表达的情况下能有效的激活NF-κB、ISRE和IFNβ启动子，并在仙台病毒刺激下协同仙台病毒诱导Ⅰ型干扰素的表达。通过shRNA干扰技术下调内源性的TRIM4表达能抑制病毒感染诱导的Ⅰ型干扰素产生。在免疫共沉淀的实验中，TRIM4能够与RIG-Ⅰ病毒感染依赖性的相互作用。进一步的研究表明，TRIM4能够促进RIG-ⅠK63链接的泛素化，从而促进RIG-Ⅰ介导的Ⅱ型干扰素的产生。从我们的研究中产生了一些新的问题，例如TRIM25是一个能够介导RIG-ⅠK63链接泛素化的E3泛素连接酶，那么TRMI4是否能够与TRIM25相关联而发挥其作用呢。此外，我们还将构建TRIM4基因敲除小鼠来验证我们的结论。 另一个TRIM蛋白家族成员TRIM21被报道在IRF3介导的信号通路中发挥着重要作用。然而，两个独立的研究组却得到了完全相反的结论。Yang研究组发现TRIM21能通过与Pin1的相互作用增加IRF3的稳定性，从而增加其对Ⅰ型干扰素的诱导。而在Higgs研究组研究中，TRIM21通过驱动IRF3的泛素化和降解来抑制Ⅰ型干扰素的产生。因此，我们构建了TRIM21基因敲除小鼠，希望能更直接的揭示TRIM21在抗病毒信号通路中的作用。我们的研究发现，TRIM21缺陷小鼠胚胎成纤维细胞相对于野生型细胞在仙台病毒感染下会产生更多的IFN-β及其RANTES。我们的研究证明，生理情况下TRIM21能够抑制病毒诱导Ⅰ型干扰素的产生。而其中具体的分子机制还有待我们进一步的研究。而且之后对TRIM21缺陷型小鼠的全面表型分析将给我们提供更多的信息。

目录

声明

摘要

1．研究背景

1．1抗病毒天然免疫中的模式识别机制

1．1．1免疫系统简介

1．1．2抗病毒天然免疫及模式识别受体

1．1．3 RIG-I样受体家族

1．1．4 Toll样受体家族

1．1．5 DNA受体

1．2抗病毒天然免疫信号转导及其调节机制

1．2．1 RLRs信号通路

1．2．2 TLRs信号通路

1．3 TRIM蛋白家族在抗病毒天然免疫中的作用

1．3．1 TRIM蛋白家族种类与结构

1．3．2 TRIM家族与免疫疾病

1．3．3 TRIM蛋白在天然免疫中的修饰作用

2．实验材料与方法

2．1实验材料

2．1．1细胞培养相关材料

2．1．2构建表达载体所需材料

2．1．3 双荧光素酶报告基因实验相关材料

2．1．4荧光实时定量PCR实验材料

2．1．5 VSV空斑实验相关材料

2．1．6 ELISA实验相关材料

2．1．7抗体

2．1．8免疫共沉淀和Western blot实验相关材料

2．1．9特殊仪器和设备

2．1．10基因敲除相关材料

2．2实验方法

2．2．1 载体构建和质粒纯化

2．2．2细胞的培养和外源基因瞬时转染实验

2．2．3 双荧光素酶报告基因和蛋白筛选实验

2．2．4 ELISA实验

2．2．5 荧光实时定量PCR实验

2．2．6 VSV吞噬空斑实验

2．2．7免疫共沉淀实验及Western blot实验

2．2．8 泛素化实验

2．2．9 BAC的抽提及纯化

2．2．11小鼠胚胎成纤维细胞的制备

3．实验结果与讨论

3．1．2实验结果与分析

3．1．3实验讨论与展望

3．2 TRIM21基因敲除小鼠的相关研究

3．2．1 研究背景与立项依据

3．2．2实验结果与分析

3．2．3实验讨论与展望

参考文献

作者简介

致谢