苏云金芽胞杆菌Cry1Ac毒蛋白对棉铃虫中肠BBMV蛋白质组的影响

摘要

本研究从苏云金芽胞杆菌（Bt） HD73中提取具有杀虫活性的毒蛋白Cry1Ac，喂食棉铃虫4龄幼虫24 h后提取其中肠BBMV。比较饲喂Bt Cry1Ac毒素后和对照棉铃虫4龄幼虫中肠BBMV蛋白质组的表达差异，从而了解Bt Cry1Ac毒素对棉铃虫的作用机理，研究其毒素受体。采用SDS—PAGE及双向电泳（2—DE）最大限度地分离BBMV蛋白，PDQUEST软件对2—DE图谱进行背景消减，斑点检测等分析，质谱鉴定胶内酶解的蛋白质点，并结合生物信息学对部份蛋白质的功能进行了分析。 我们获得了正常幼虫及饲喂Cry1Ac毒素24h后的幼虫中肠BBMV蛋白的SDS—PAGE图谱。切取61个蛋白条带进行胰酶酶解，并利用电喷雾—四级杆—飞行时间质谱（electrspectrometry ionization—quadrupole—time of flight，ESI—Q—TOF）和离子阱液质联用（HCT）进行测定，经MASCOT的Swissprot搜索，获得了149个非冗余蛋白质。这些蛋白质主要包括氨肽酶N，肌动蛋白（Actin），类胰蛋白酶（trypsin—like protease），液泡ATP合酶催化亚单位A（Vacuolar ATP synthase catalytic subunit A）等。从SDS—PAGE电泳图谱显示，饲喂毒素后的棉铃虫中肠主要受体氨肽酶N的表达量比正常的明显上调。 运用PDQUEST软件对扫描后的2—DE图谱进行分析，检测到了一定数量的蛋白质点。在相同条件下识别的蛋白质斑点数分别为未饲喂毒素271个，饲喂毒素后241个。通过比较饲喂Cry1Ac毒素与对照棉铃虫BBMV蛋白在双向电泳图谱中的分布位置及表达量的变化，显示出主要蛋白质点的位置及丰度有一定的差异。特别是鉴定到的蛋白质中有28个蛋白点的表达差异较大，包括ATP酶、肌动蛋白、精氨酸激酶等。通过饲喂Cry1Ac毒素后与对照棉铃虫4龄幼虫中肠BBMV蛋白质组的表达差异，为阐明昆虫体内毒蛋白特异受体的作用机理和棉铃虫抗性产生的原因提供了重要依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写表(中英文对照)

声明

引言

1.蛋白质组学研究

1.1蛋白质组学概述

1.2蛋白质组学的技术进展

1.3蛋白质组的应用研究

1.4昆虫蛋白质组学及Bt毒素受体的研究现状

2.苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的研究

2.1 Bt杀虫晶体蛋白的基本特征

2.2 Bt杀虫晶体蛋白的结构及其功能

2.3 Bt杀虫晶体蛋白的作用过程及杀虫机制

3.本文的研究的背景和思路

材料与方法

1.材料

1.1供试菌株

1.2供试虫源

1.3培养基

1.4主要试剂

1.5主要仪器

2.方法

2.1菌体培养与晶体蛋白的分离

2.2蛋白质含量的测定

2.3 CrylAc晶体蛋白的SDS-PAGE分析

2.4 Bt CrylAc原毒素对棉铃虫的生物活性测定

2.5毒素的饲喂及中肠的切取

2.6 BBMV样品的提取及制备

2.7双向电泳

2.8双向凝胶染色

2.9凝胶图谱分析

2.10蛋白质的原位酶解

2.11质谱鉴定

结果与分析

1.菌体培养与晶体蛋白的分离

2.CrylAc蛋白质含量测定及SDS-PAGE分析

3.生物活性测定、毒素的饲喂及中肠的切取

4.BBMV蛋白样品的SDS-PAGE分析及质谱鉴定

5.BBMV蛋白样品的双向电泳分析及质谱鉴定

讨论

1.BBMV蛋白样品双向电泳条件的摸索

2.未饲喂毒素与饲喂毒素后的BBMV蛋白样品比较分析

3.SDS-PAGE及双向电泳鉴定结果的比较分析

结语

参考文献

附录：硕士期间撰写、发表与课题相关的学术论文