猪肝羧酸酯酶1基因的克隆和在原核细胞中的功能性表达

摘要

为获得有活性的猪肝羧酸酯酶1(PLE1)并研究其功能,利用RT-PCR与常规PCR方法,从大白猪肝组织中扩增PLE1基因的ORF.将PLE1的ORF序列连接到pET15b原核表达载体,在OrigamiTM2 (DE3)中与pGro7质粒共诱导表达,纯化目的蛋白质并检测其酶活性.测序结果表明克隆到PLE1基因编码区全长1 686 bp的片段,该片段编码562个氨基酸.SDS-PAGE和Western blotting结果显示,PLE1融合蛋白质成功表达,在30℃的培养温度下,IPTG诱导6h后,PLE1重组蛋白质表达量最高,且大部分以可溶性形式存在.酶活性试验结果表明,PLE1融合蛋白质水解底物p-NPA的酶活力为1.24 U.研究结果不仅为研究PLE1水解兽药特性提供高纯度的具有原有酶活性的重组蛋白质,也为PLE同工酶家族其他重要成员的活性功能研究提供理论依据和技术手段.