副猪嗜血杆菌Apd-ELISA抗体检测试剂盒的制备和初步应用

摘要

旨在对副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)的黏附素蛋白(autotransporter passenger domain,Apd) ELISA抗体检测方法进行参数优化、临界值确定和应用评价,获得性能稳定的副猪嗜血杆菌病抗体检测试剂盒.首先通过猪的免疫攻毒试验获得HPS阴、阳性对照血清,优化Apd-ELISA的反应参数;然后用背景确认的阴、阳性血清确定其临界值,并对封闭液及酶标板的包装方式进行选择;最后用Apd-ELISA试剂盒对临床样品进行检测并与荷兰Biocheck的OppA-ELISA试剂盒进行比较.结果 表明,抗原包被质量浓度为0.5tμg·mL-1、被检血清以1∶200倍稀释后反应45 min以及二抗稀释度为1∶15 000时,Apd-ELISA的反应背景下降,区分度提高.根据背景确认的27份阳性和40份阴性血清的(OD)630nm值以及临界值计算公式(S-N)/(P-N),得到Apd-ELISA的阴阳性临界值是0.33.证实用封闭液K封闭和真空包装的酶标板可以在50℃保存4d(相当于在4℃保存22个月).用Apd-ELISA试剂盒检测1 179份临床血清,表明母猪、后备和育肥猪以及仔猪的HPS血清阳性率分别为83.76％、61.09％和27.48％.与荷兰的Biocheck试剂盒进行比较,发现Apd-ELISA与Biocheck试剂盒(OppA-ELISA)对HPS临床阴性血清和疫苗免疫血清检测的符合率为100％,对HPS临床阳性血清的符合率仅为4.76％(6/126).然而,Apd-ELISA与OppA Western blot的阳性符合率可达到73.02％(92/126).本研究获得了能有效区分HPS阴、阳性血清和稳定保存的Apd-ELISA抗体检测试剂盒,可用于HPS灭活疫苗免疫后的抗体检测和副猪嗜血杆菌病的血清抗体检测.