应用G3BP1稳转细胞系监测应激状态下的应激颗粒形成

摘要

哺乳动物细胞受到应激刺激后,会在细胞中形成致密的颗粒状结构,该结构被称为应激颗粒(stress granules,SG),其中G3BP1是应激颗粒重要的组成成分和标志蛋白.为了动态监测SG的形成情况,构建稳定表达GFP-G3BP1蛋白的HeLa细胞系.首先,扩增G3BP1基因,并将其克隆到慢病毒载体中,从而获得重组质粒Lenti-GFP-G3BP1,利用三质粒慢病毒包装系统包装为表达GFP-G3BP1蛋白的慢病毒颗粒,并感染HeLa细胞,通过嘌呤霉素初步筛选阳性细胞,随后,采用有限稀释法筛选出稳定表达GFP-G3BP1蛋白的HeLa单克隆细胞系,并采用Western blot和直接免疫荧光方法检测细胞系中GFP-G3BP1蛋白的表达及功能.结果 发现,在荧光显微镜下可以观察到明显的G3BP1细胞质特异性荧光,Western blot结果显示GFP-G3BP1特异性条带,说明稳定表达GFP-G3BP1的HeLa细胞系构建成功.最后,作者利用亚砷酸钠/热休克/新城疫病毒处理细胞系后对GFP-G3BP1表达形态进行动态监测,证实了细胞受到刺激后,SG逐渐积累的过程.该细胞和相关动态监测方法为后续SG和新城疫病毒的相关研究奠定了基础.