鸡Apob基因组织表达与CRISPR/Cas9敲除系统的构建

摘要

旨在探究Apob基因在鸡肝脂质代谢过程中的功能.本研究对鸡Apob蛋白进行理化性质分析;利用RT-qPCR检测Apob基因在4周龄黄羽肉鸡组织中的表达情况,每组设置3个重复,进行3次平行试验.根据鸡Apob蛋白关键结构域,在Apob基因外显子设计3对sgRNA,构建Cas/gRNA载体;将重组质粒转染DF-1细胞后,利用T7核酸内切酶Ⅰ(T7 endonuclease I,T7EⅠ)酶切法和TA克隆测序法筛选敲除活性位点并计算敲除效率.利用RT-qPCR检测基因敲除后亚克隆细胞中Apob基因mRNA表达情况.结果表明,鸡Apob的相对分子质量为523.356 ku,平均亲水性为-0.300,为稳定的蛋白质,并且该基因主要在鸡的肝、肾和小肠组织表达.敲除载体转染至DF-1细胞后,T7EⅠ酶切发现,Cas/gRNA6、Cas/gRNA7和Cas/gRNA8三个位点均可发挥敲除活性,TA克隆测序结果表明,三者的敲除效率分别为33.3％、65％和80％.同时,RT-qPCR结果显示,转染Cas9/gRNA7、Cas9/gRNA6、Cas9/gRNA8的细胞中 Apob 基因 mRNA 表达水平约分别下调99.96％(P＜0.01)、85％(P＜0.01)、47％(P＜0.05).综上所述,本研究揭示了鸡Apob基因在组织中的表达特点和蛋白的理化性质;成功构建了鸡Apob基因CRISPR/Cas9敲除载体,并筛选出最佳敲除位点,获得了 Apob基因敲除的亚克隆细胞,为进一步探索Apob基因在鸡肝中的功能奠定了基础.