SD大鼠视网膜神经节细胞体外分离培养及高糖模型建立

摘要

目的:体外分离新生SD大鼠视网膜神经节细胞(RGCs),建立新生SD大鼠RGCs体外原代培养方法及高糖模型.方法:取15～20只出生1～3d SD大鼠的视网膜组织,分离纯化RGCs进行原代培养.甲苯胺蓝法及免疫荧光细胞染色法进行鉴定.细胞连续培养48～72h后,随机分为6组并分别加入含不同葡萄糖浓度5.5、20、25、30、35、40mmol/L的培养基培养24、48、72h,采用CCK8法及TUNEL凋亡检测法分析各组细胞存活率及凋亡率.结果:离体纯化原代培养的RGCs具有典型的细胞形态且生长良好,细胞之间呈小片状融合聚集生长,轴突相互交错成网络状,胞体周围可见细胞光晕.甲苯胺蓝着染细胞胞质中可见结构清晰的尼式小体,神经元率达95％以上.RGCs特异性抗体Thy-1、Brn-3a定体外纯化培养细胞,阳性率达90％以上.CCK8检测发现随着时间及葡萄糖浓度的增加,各组细胞的存活率降低;在不同葡萄糖浓度干预细胞24h时,各分组之间OD值均小于正常对照组,但与正常对照组相比较OD值大小无差异(均P>0.05);随着时间延长,35、40mmol/L葡萄糖浓度干预RGCs 48h,30、35、40mmol/L干预RGCs 72h时的OD值较正常对照组OD值明显降低(均P<0.05).TUNEL检测发现随着葡萄糖浓度及时间的增加,RGCs凋亡率增加.其中葡萄糖浓度为30、35、40mmol/L培养RGCs 48、72h后RGCs细胞凋亡率与正常对照组相比较有差异(均P<0.05).结论:本研究建立的RGCs体外原代培养方法能获得典型且纯度较高的RGCs,随着葡萄糖浓度的增加,体外纯化培养的RGCs存活率降低,凋亡率增加.35mmol/L葡萄糖浓度干预RGCs 48h可为有效诱导RGCs建立高糖模型最佳干预浓度及时间.