PSMA增强子/启动子特异性驱动shRNA靶向干扰EGFP的研究

摘要

目的:探讨前列腺特异性膜抗原增强子、启动子(PSMAe/p)驱动shRNA转录效果,比较何种终止序列最有效.方法:分别以poly(A),minipoly(A),poly(U)为终止序列设计针对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的干扰序列,克隆入经Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切的pPSMAe/p载体上.然后通过脂质体介导,将各重组干扰质粒与pEGFP-C1质粒共转染PC-3和LNCaP细胞.采用荧光显微镜,流式细胞仪,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测EGFP在各组细胞中的干扰效果.结果:重组质粒中成功插入了目的基因片段;荧光显微镜和流式测定结果显示各干扰质粒与pEGFP-C1质粒共转染LNCaP后,各干扰组荧光表达均有不同程度减少,与空载体组相比均有统计学差异(P＜0.01),pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)组减少与pPSMAe/p-shEGFP-minipoly(A)组相比有统计学差异(P＜0.05),与pPSMAe/p-shEGFP-poly(U)组相比有显著统计学差异(P＜0.01).各干扰载体与pEGFP-C1质粒共转染PC-3后各组荧光表达无统计学差异(P＞0.05).EGFPmRNA和蛋白表达水平无明显差异;LNCaP细胞各干扰组中EGFPmRNA和蛋白表达与空载体对照组相比均有不同程度下降,以pPSMAe/p-sh.EGFP-poly(A)组最为明显.结论:成功构建了针对EGFP的RNA干扰表达载体pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)、pPSMAe/p-shEGFP-minipoly(A)和pPSMAe/p-shEGFP-poly(U);PSMAe/p可特异性驱动shRNA转录;poly(A)终止信号终止转录最有效.