酶双循环法测定一氧化氮合酶活性实验条件探讨

摘要

目的运用Wang法与酶双循环法联合测定血清中一氧化氮合酶(NOS)活性.方法先改良Wang法测定NOS活性的实验条件,再探讨Wang法与酶双循环法偶联的实验条件,比较酶双循环前后检测物性质.结果总NOS(tNOS)测定试剂由20 mmol/L L-精氨酸、25μmol/L还原型辅酶Ⅱ(NADPH+H+)、50.0μmol/LCaCl2、45.0μmol/L二硫苏糖醇(DTT)、36.0μmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、1.8μmol/L苯甲磺酰氯(PMSF)、80μmol/L尼克酰胺、1μg/ml钙调蛋白(CalM)和10μg/ml蛋白酶抑制剂Antipain组成.以上试剂添加诱导性NOS(iNOS)抑制剂NW-硝基-D-精氨酸用于测定结构型NOS(cNOS).对NOS生成的氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)采用酶双循环产物6-磷酸葡萄糖酸(6PG)脱氢生成的大量NADPH+H+,其放大倍数约为70～80倍.结论酶双循环法提高了测定NOS的灵敏度.