具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱同双核配合物的合成及其药物组合物

摘要

本发明涉及一种具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱同双核配合物的合成及其药物组合物，包括：(1)叠氮桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铜同双核配合物的合成；(2)叠氮桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱锌同双核配合物的合成；(3)硫氰酸根桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铂同双核配合物的合成；(4)叠氮桥联昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铜同双核配合物的合成；(5)草酸根桥联昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铂同双核配合物的合成，并针对上述化合物进行药理学分析研究。本发明化合物具抗癌活性作用，适合在抗癌领域中使用，具有较大的医学和药学价值，为抗癌药物的研究开发和应用推广提供了一条重要的依据。

说明书

技术领域

本发明涉及具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱同双核配合物的合成及其药物组合物，属 于药物合成技术领域。

背景技术

20世纪90年代，进口的顺铂和卡铂抗癌药物相继被我国相关部门批准上市。大约 65％的临床联合化疗方案以它们为主药或参与配伍。这奠定了金属配位化合物作为有效 抗癌药物的重要地位。但顺铂和卡铂抗癌药物因肾毒性和引发的恶心呕吐等副作用比较 大，这促使人们突破传统顺铂结构理念，去开发更好的金属配合物抗癌药物是该领域的 研究趋势。

随着人们对金属配合物的药理作用认识，新的高效、低毒、具有抗癌活性的金属配 合物不断被合成出来。其中包括某些新型铂配合物、希夫碱配合物、有机锡配合物、有 机锗配合物、茂钛衍生物、稀土配合物、多酸化合物等，如CN102807576A 提出了一种具有抗癌活性的双水杨醛缩联合P t(II)胺配合物。但目前能应用于临床 的抗癌药物还是和需求相差太远，亟待扩大抗癌药物的候选队伍。

昆布氨酸是源自海洋植物海带中的一种具有独特生物活性的非蛋白质氨基酸，用其 合成抗癌新药具有天然无毒、可水溶性、生物相容性好的优点，是目前尚待开发的医药 宝库。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱同双核配合物的合成及 其药物组合物，并进行药理学分析，以表征该化合物的具抗癌活性作用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。

具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱同双核配合物的合成及其药物组合物，包括：(1)叠 氮桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铜同双核配合物的合成；(2)叠氮桥联昆布氨酸缩 2-吡啶甲醛希夫碱锌同双核配合物的合成；(3)硫氰酸根桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希 夫碱铂同双核配合物的合成；(4)叠氮桥联昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铜同双核 配合物的合成；(5)草酸根桥联昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铂同双核配合物的合 成。具体如下：

(1)叠氮桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铜同双核配合物的合成步骤为：

步骤A：将40mmol(4.28g)2-吡啶甲醛用10mL无水乙醇稀释，缓慢滴加到溶解有 40mmol(7.56g)昆布氨酸的40mL乙醇溶液中。滴加完毕后温度缓慢升至70℃，继续反 应4小时。蒸发溶液至余下约5mL，加入冰乙醇20mL，有大量沉淀生成。将溶液过滤， 分别用冰乙醇、乙醚洗涤多次，真空干燥，得白色目标产物即为昆布氨酸缩2-吡啶甲醛 希夫碱。

步骤B：将40mmol(7.56g)CuCl₂·3H₂O用10mL无水乙醇稀释，缓慢滴加到溶解有 40mmol(11.08g)昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱的40mL乙醇溶液中。滴加完毕后温度 缓慢升至70℃，继续反应4小时。蒸发溶液至余下约10mL，加入冰乙醇20mL，有大量 沉淀生成。将溶液过滤，分别用冰乙醇、乙醚洗涤多次，真空干燥，得蓝色目标产物， 昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铜单核配合物配体。

步骤C：40mmol(2.60g)NaN₃用10mL无水乙醇稀释，滴加到40mL溶解有80mmol (30.42g)昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱锌单核配合物的无水乙醇溶液中。滴加完毕后温 度缓慢升至70℃，继续反应4小时。蒸发溶液至余下约10mL，加入冰乙醇20mL，有大 量沉淀生成。将溶液过滤，分别用冰乙醇、乙醚洗涤多次，真空干燥，得灰白色目标产 物。

室温下目标产物很稳定，均难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，可以 溶于水。

(2)叠氮桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱锌同双核配合物的合成步骤为：

步骤A：按制备例1步骤A所示方法合成昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱。

步骤B：按制备例1步骤B所示方法合成昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铜单核配合物 配体，将CuCl₂·3H₂O用ZnCl₂代替，获得预期产物。

步骤C：40mmol(2.60g)NaN₃用10mL无水乙醇稀释，滴加到40mL溶解有80mmol (30.42g)昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱锌单核配合物的无水乙醇溶液中。滴加完毕后 温度缓慢升至70℃，继续反应4小时。蒸发溶液至余下约10mL，加入冰乙醇20mL，有 大量沉淀生成。将溶液过滤，分别用冰乙醇、乙醚洗涤多次，真空干燥，得灰白色目标 产物。

室温下目标产物很稳定，均难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，可以 溶于水。

(3)硫氰酸根桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铂同双核配合物的合成步骤为：

步骤A：按制备例1步骤A所示方法合成昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱。

步骤B：按制备例1步骤B所示方法合成昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铂单核配合物 配体，将CuCl₂·3H₂O用K₂PtCl₄代替，获得预期产物。

步骤C：按制备例1步骤C合成硫氰酸根桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铂同双核 配合物，将叠氮化钠用硫氰酸钠代替，获得预期产物。

室温下目标产物很稳定，均难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，可以 溶于水。

(4)叠氮桥联昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铜同双核配合物的合成，合成步 骤为：

步骤A：按制备例1步骤A所示方法合成昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱，将2-吡 啶甲醛用3，5-二溴水杨醛代替。

步骤B：按制备例1步骤B所示方法合成昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铜单核配 合物配体。

步骤C：按制备例1步骤C合成叠氮桥联昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铜同双核 配合物。

室温下目标产物很稳定，均难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，可以 溶于水。

(5)草酸根桥联昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铂同双核配合物的合成步骤为：

步骤A：按制备例1步骤A所示方法合成昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱，将2-吡 啶甲醛用3，5-二溴水杨醛代替。

步骤B：按制备例1步骤B所示方法合成昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铂单核配 合物配体。

步骤C：按制备例1步骤C合成草酸根桥联昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铂同双 核配合物，将叠氮化钠用草酸钠代替。

室温下该配合物很稳定，均难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，可以 溶于水。

针对上述化合物进行药理学分析研究，具体包括：

(1)化合物与DNA相互作用的研究：应用鲱鱼鱼精DNA(HS-DNA)作为研究对象。 鲱鱼鱼精DNA(HS-DNA)用NaCl/Tris-HCl(pH＝7.16)缓冲溶液配制成10^-4M的溶液，测 量260nm和280nm处的吸光度(A)，A260/A280在1.8～1.9的范围内，说明HS-DNA 溶液符合实验要求。测量HS-DNA在260nm处的吸光度，根据朗姆-比尔定律计算DNA 的浓度(以DNA碱基对的摩尔浓度计，ε260＝6600L·mol^-1·cm^-1)。

紫外吸收光谱滴定：化合物用NaCl/Tris-HCl缓冲溶液配成10^-3M的溶液，然后稀 释到10^-5M的浓度；以NaCl/Tris-HCl缓冲溶液作为空白对照液，测定200～800nm波 长范围内的紫外光谱。每次加样，分别向空白和配体样品中加入等量配制好的HS-DNA 溶液(10^-3M)，充分混合然后静止10min后再进行扫描。键合常数由以下公式确定：

[DNA]/(ε_a-ε_f)＝[DNA]/(ε_a-ε_f)+1/K_b(ε_a-ε_f)

其中[DNA]代表DNA的浓度，ε_a，ε_f和ε_b分别代表在各DNA浓度下的、游离的和 与DNA键合饱和的配体的摩尔吸光系数。以[DNA]/(ε_a-ε_f)对[DNA]作图，键合常数K_b为直线的斜率和截距之比。

荧光猝灭光谱滴定：EB-DNA复合体系的配制：将5μLEB(1×10^-3mol·L^-1)溶液 加入到1mL HS-DNA(10^-3M)溶液中置于10mL比色管中，常温下避光保存2h。然后 加入NaCl/Tris-HCl缓冲溶液稀释至5mL，混合均匀后。以522nm的波长激发，记录 EB-DNA复合体系在584nm处的荧光发射波长及强度。每次加样，向样品中加入等量配 制好的配体配体样品溶液(10^-3M)，记录不同浓度配体对EB-DNA复合体系的荧光猝灭光 谱。猝灭系数由Stern-Volmer公式确定：

I₀/I＝1+K_sv[Q]

其中I0和I分别代表不加化合物和加化合物时EB-DNA复合体系的的荧光强度；[Q] 表示猝灭剂(化合物)的浓度。以I₀/I对[Q]作图，斜率即为猝灭常数K_sv。

(2)化合物与BSA相互作用的研究：应用牛血清白蛋白(BSA)作为研究对象。紫 外吸收光谱滴定：将配制好的BSA储备液(100μM)稀释到10μM，以NaCl/Tris-HCl 缓冲溶液作为空白对照，测定200～350nm波长范围内的紫外光谱，每次加样分别向空 白和BSA样品中加入等量配制好的化合物溶液(10^-3M)，充分混合然后静止10min后再 进行扫描。

色氨酸荧光猝灭光谱滴定：将配制好的BSA储备液(100μM)稀释到10μM，以295 nm的波长激发，记录BSA溶液在584nm处的荧光发射波长及强度。每次加样，向样品 中加入等量配制好的化合物样品溶液(10^-3M)，记录不同浓度化合物对BSA溶液的荧光 猝灭光谱。

猝灭系数由Stern-Volmer公式确定：

I₀/I＝1+K_sv[Q]＝1+K_qτ₀[Q]

其中I₀和I分别代表不加化合物(配合物)和加化合物(配合物)时的荧光强度；[Q] 表示化合物(配合物)的浓度；K_sv为动态猝灭常数；K_q为动态猝灭速率常数；τ₀为无猝 灭剂是荧光分子的平均寿命(10^-8s^-1)。以I₀/I对[Q]作图，斜率即为K_sv。各类荧光猝 灭剂对生物大分子的最大动态荧光猝灭速率常数约为2.0×10¹⁰L·mol^-1·s^-1。通过 K_sv＝K_qτ₀，可以求得K_q。

在静态猝灭过程中，假设在生物大分子上有两到三个相似又彼此独立的结合位点， 则荧光强度与猝灭剂之间的关系可表示为公式：

nQ+B→Q_n…B

其中B表示发荧光的生物大分子，Q是猝灭剂分子，Q_n…B表示生成的无荧光强度的 生物分子，其生成常数可表示为：

K＝[Q_n…B]/[Q]n[B]

如果生物大分子的总浓度为B₀，则[B₀]＝[Q_n…B]+[B]，[B]表示未结合的生物大 分子的浓度，则荧光强度和未结合的生物大分子的浓度的关系为[B]/[B₀]＝F/F₀，F₀和 F分别表示未加猝灭剂和加入猝灭剂时生物大分子的荧光强度。从以上关系中可推出公 式：

log[(F₀-F)/F]＝logK+nlog[Q]

其中K表示猝灭剂和生物大分子的结合常数，n表示猝灭剂和生物大分子的结合位 点数，以log[(F₀-F)/F]对log[Q]作图，斜率即为n，由截据可以求得结合常数K。

(3)本发明化合物的体外细胞毒试验使用SRB检测法，测定了加入上述化合物后， 培养基在515nm处的OD读数，由测得的OD值，通过如下公式计算待测样品对人肝癌 细胞株(SMMC-7721)、肺腺癌细胞株(A549)细胞、人急性早幼粒白血病(HL-60)和正常 小鼠角质细胞(Pam212)的抑制率：

以被测样品浓度对抑制率做线性回归，求出其48h内的半数抑制浓度(IC₅₀)。以顺铂作 为阳性对照。

该发明的有益效果在于：本发明提供了一种具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱同双核配 合物的合成及其药物组合物的合成方法，并进行了药理学分析，证明该化合物的具抗癌 活性作用，适合在抗癌领域中使用。本发明方法找到了一种新的药物合成方法，具有较 大的医学和药学价值，为抗癌药物的研究开发和应用推广提供了一条重要的依据。

附图说明

图1是本发明实施例1中所合成的叠氮桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铜同双 核配合物结构式。

图2是本发明实施例2中所合成的叠氮桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱锌同双核 配合物的结构式。

图3是本发明实施例3中所合成的硫氰酸根桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铂同 双核配合物结构式。

图4是本发明实施例4中所合成的叠氮桥联昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铜同 双核配合物的结构式。

图5是本发明实施例5中所合成的草酸根桥联昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铂 同双核配合物的结构式。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式进行描述，以便更好理解本发明。

实施例1：

叠氮桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铜同双核配合物的合成步骤为：

步骤A：将40mmol(4.28g)2-吡啶甲醛用10mL无水乙醇稀释，缓慢滴加到溶解有 40mmol(7.56g)昆布氨酸的40mL乙醇溶液中。滴加完毕后温度缓慢升至70℃，继续反 应4小时。蒸发溶液至余下约5mL，加入冰乙醇20mL，有大量沉淀生成。将溶液过滤， 分别用冰乙醇、乙醚洗涤多次，真空干燥，得白色目标产物即为昆布氨酸缩2-吡啶甲醛 希夫碱。

步骤B：将40mmol(7.56g)CuCl₂·3H₂O用10mL无水乙醇稀释，缓慢滴加到溶解有 40mmol(11.08g)昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱的40mL乙醇溶液中。滴加完毕后温度 缓慢升至70℃，继续反应4小时。蒸发溶液至余下约10mL，加入冰乙醇20mL，有大量 沉淀生成。将溶液过滤，分别用冰乙醇、乙醚洗涤多次，真空干燥，得蓝色目标产物， 昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铜单核配合物配体。

步骤C：40mmol(2.60g)NaN3用10mL无水乙醇稀释，滴加到40mL溶解有80mmol (30.42g)昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱锌单核配合物的无水乙醇溶液中。滴加完毕后温 度缓慢升至70℃，继续反应4小时。蒸发溶液至余下约10mL，加入冰乙醇20mL，有大 量沉淀生成。将溶液过滤，分别用冰乙醇、乙醚洗涤多次，真空干燥，得灰白色目标产 物。图1是本发明实施例1中所合成的叠氮桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铜同双核 配合物结构式。IR峰位及元素微量分析结果见表1和表2。室温下目标产物很稳定，均难 溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，可以溶于水。

表1：实施例1目标物IR峰位

表2：实施例1目标物元素微量分析

实施例2：

叠氮桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱锌同双核配合物的合成步骤为：

步骤A：按制备例1步骤A所示方法合成昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱。

步骤B：按制备例1步骤B所示方法合成昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铜单核配合物 配体，将CuCl₂·3H₂O用ZnCl₂代替，获得预期产物。

步骤C：40mmol(2.60g)NaN₃用10mL无水乙醇稀释，滴加到40mL溶解有80mmol (30.42g)昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱锌单核配合物的无水乙醇溶液中。滴加完毕后 温度缓慢升至70℃，继续反应4小时。蒸发溶液至余下约10mL，加入冰乙醇20mL，有 大量沉淀生成。将溶液过滤，分别用冰乙醇、乙醚洗涤多次，真空干燥，得灰白色目标 产物。图2是本发明实施例2中所合成的叠氮桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱锌同双 核配合物的结构式。IR峰位及元素微量分析结果见表3和表4。室温下目标产物很稳定， 均难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，可以溶于水。

表3：实施例2目标物IR峰位

表4：实施例2目标物元素微量分析

元素微量分析： C％ H％ N％ 计算值 49.52 6.37 17.33 实测值 49.68 6.55 17.49

实施例3：

硫氰酸根桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铂同双核配合物的合成步骤为：

步骤A：按制备例1步骤A所示方法合成昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱。

步骤B：按制备例1步骤B所示方法合成昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铂单核配合物配 体，将CuCl₂·3H₂O用K₂PtCl₄代替，获得预期产物。

步骤C：按制备例1步骤C合成硫氰酸根桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铂同双核 配合物，将叠氮化钠用硫氰酸钠代替，获得预期产物。

图3是本发明实施例3中所合成的硫氰酸根桥联昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱铂 同双核配合物结构式。IR峰位及元素微量分析结果见表5和表6。室温下目标产物很稳 定，均难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，可以溶于水。

表5：实施例3目标物IR峰位

表6：实施例3目标物元素微量分析

元素微量分析： C％ H％ N％ 计算值 37.12 4.62 9.78 实测值 37.18 4.54 9.56

实施例4：

叠氮桥联昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铜同双核配合物的合成步骤为：

步骤A：按制备例1步骤A所示方法合成昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱，将2-吡 啶甲醛用3，5-二溴水杨醛代替。

步骤B：按制备例1步骤B所示方法合成昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铜单核配 合物配体。

步骤C：按制备例1步骤C合成叠氮桥联昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铜同双核 配合物。

图4是本发明实施例4中所合成的叠氮桥联昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铜 同双核配合物的结构式。IR峰位及元素微量分析结果见表7和表8。室温下目标产物很 稳定，均难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，可以溶于水。

表7：实施例4目标物IR峰位

表8：实施例4目标物元素微量分析

元素微量分析： C％ H％ N％ 计算值 33.70 3.89 8.60 实测值 33.58 4.01 8.51

实施例5：

草酸根桥联昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铂同双核配合物的合成步骤为：

步骤A：按制备例1步骤A所示方法合成昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱，将2-吡 啶甲醛用3，5-二溴水杨醛代替。

步骤B：按制备例1步骤B所示方法合成昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铂单核配 合物配体。

步骤C：按制备例1步骤C合成草酸根桥联昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱铂同双 核配合物，将叠氮化钠用草酸钠代替。

图5是本发明实施例5中所合成的草酸根桥联昆布氨酸缩3，5-二溴水杨醛希夫碱 铂同双核配合物的结构式。IR峰位及元素微量分析结果见表9和表10。室温下该配合 物很稳定，均难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，可以溶于水。

表9：实施例5目标物IR峰位

表10：实施例5目标物元素微量分析

元素微量分析： C％ H％ N％ 计算值 29.62 3.22 4.06 实测值 29.44 3.36 4.19

实施例6：

针对上述化合物进行药理学分析研究，具体包括：

(1)化合物与DNA相互作用的研究：

本发明化合物与DNA相互作用能力研究，应用鲱鱼鱼精DNA(HS-DNA)作为研究对象。 鲱鱼鱼精DNA(HS-DNA)用NaCl/Tris-HCl(pH＝7.16)缓冲溶液配制成10^-4M的溶液，测 量260nm和280nm处的吸光度(A)，A260/A280在1.8～1.9的范围内，说明HS-DNA 溶液符合实验要求。测量HS-DNA在260nm处的吸光度，根据朗姆-比尔定律计算DNA 的浓度(以DNA碱基对的摩尔浓度计，ε260＝6600L·mol^-1·cm^-1)。

紫外吸收光谱滴定：化合物用NaCl/Tris-HCl缓冲溶液配成10^-3M的溶液，然后稀 释到10^-5M的浓度；以NaCl/Tris-HCl缓冲溶液作为空白对照液，测定200～800nm波 长范围内的紫外光谱。每次加样，分别向空白和配体样品中加入等量配制好的HS-DNA 溶液(10^-3M)，充分混合然后静止10min后再进行扫描。键合常数由以下公式确定：

[DNA]/(ε_a-ε_f)＝[DNA]/(ε_a-ε_f)+1/K_b(ε_a-ε_f)

其中[DNA]代表DNA的浓度，ε_a，ε_f和ε_b分别代表在各DNA浓度下的、游离的和 与DNA键合饱和的配体的摩尔吸光系数。以[DNA]/(ε_a-ε_f)对[DNA]作图，键合常数K_b为直线的斜率和截距之比。

本发明所获得的代表化合物的紫外吸收光谱滴定作用结果列于表11中。

表11：本发明所获得的代表化合物的紫外吸收光谱滴定作用结果

化合物 K_b×10^-4(M^-1) 制备例1 9.53 制备例2 9.42 制备例3 9.37 制备例4 11.94 制备例5 12.10

荧光猝灭光谱滴定：EB-DNA复合体系的配制：将5μLEB(1×10^-3mol·L^-1)溶液 加入到1mL HS-DNA(10^-3M)溶液中置于10mL比色管中，常温下避光保存2h。然后 加入NaCl/Tris-HCl缓冲溶液稀释至5mL，混合均匀后。以522nm的波长激发，记录 EB-DNA复合体系在584nm处的荧光发射波长及强度。每次加样，向样品中加入等量配 制好的配体配体样品溶液(10^-3M)，记录不同浓度配体对EB-DNA复合体系的荧光猝灭光 谱。

猝灭系数由Stern-Volmer公式确定：

I₀/I＝1+K_sv[Q]

其中I₀和I分别代表不加化合物和加化合物时EB-DNA复合体系的的荧光强度；[Q]表 示猝灭剂(化合物)的浓度。以I₀/I对[Q]作图，斜率即为猝灭常数K_sv。

本发明所获得的代表化合物的荧光猝灭光谱滴定作用结果列于表12中。

表12：本发明所获得的代表化合物的荧光猝灭光谱滴定作用结果

化合物 K_sv×10^-4制备例1 9.04 制备例2 9.14 制备例3 8.97 制备例4 17.11 制备例5 19.07

(2)化合物与BSA相互作用的研究：

本发明化合物与蛋白相互作用能力研究，应用牛血清白蛋白(BSA)作为研究对象。 紫外吸收光谱滴定：将配制好的BSA储备液(100μM)稀释到10μM，以NaCl/Tris-HCl 缓冲溶液作为空白对照，测定200～350nm波长范围内的紫外光谱，每次加样分别向空 白和BSA样品中加入等量配制好的化合物溶液(10^-3M)，充分混合然后静止10min后再 进行扫描。

色氨酸荧光猝灭光谱滴定：将配制好的BSA储备液(100μM)稀释到10μM，以295 nm的波长激发，记录BSA溶液在584nm处的荧光发射波长及强度。每次加样，向样品 中加入等量配制好的化合物样品溶液(10^-3M)，记录不同浓度化合物对BSA溶液的荧光 猝灭光谱。

猝灭系数由Stern-Volmer公式确定：

I₀/I＝1+K_sv[Q]＝1+K_qτ₀[Q]

其中I₀和I分别代表不加化合物(配合物)和加化合物(配合物)时的荧光强度；[Q] 表示化合物(配合物)的浓度；K_sv为动态猝灭常数；K_q为动态猝灭速率常数；τ₀为无猝 灭剂是荧光分子的平均寿命(10^-8s^-1)。以I₀/I对[Q]作图，斜率即为K_sv。各类荧光猝 灭剂对生物大分子的最大动态荧光猝灭速率常数约为2.0×10¹⁰L·mol^-1·s^-1。通过 K_sv＝K_qτ₀，可以求得K_q。

在静态猝灭过程中，假设在生物大分子上有两到三个相似又彼此独立的结合位点， 则荧光强度与猝灭剂之间的关系可表示为公式：

nQ+B→Q_n…B

其中B表示发荧光的生物大分子，Q是猝灭剂分子，Q_n…B表示生成的无荧光强度的 生物分子，其生成常数可表示为：

K＝[Q_n…B]/[Q]n[B]

如果生物大分子的总浓度为B₀，则[B₀]＝[Q_n…B]+[B]，[B]表示未结合的生物大 分子的浓度，则荧光强度和未结合的生物大分子的浓度的关系为[B]/[B₀]＝F/F₀，F₀和 F分别表示未加猝灭剂和加入猝灭剂时生物大分子的荧光强度。从以上关系中可推出公 式：

log[(F₀-F)/F]＝logK+nlog[Q]

其中K表示猝灭剂和生物大分子的结合常数，n表示猝灭剂和生物大分子的结合位点 数，以log[(F₀-F)/F]对log[Q]作图，斜率即为n，由截据可以求得结合常数K。

本发明所获得的代表化合物的色氨酸荧光猝灭光谱滴定作用结果列于表13中。

表13：本发明所获得的代表化合物的色氨酸荧光猝灭光谱滴定作用结果

化合物 K_sv×10^-4(M^-1) K_q×10^-12(L·mol^-1·s^-1) n K×10^-4(M^-1) 制备例1 6.18 6.18 1.14 30.7 制备例2 6.36 6.36 1.14 33.2 制备例3 5.77 5.77 1.14 27.4 制备例4 9.66 9.66 1.20 68.2 制备例5 9.43 9.43 1.20 66.1

(3)本发明化合物的体外细胞毒试验使用SRB检测法，测定了加入从上述实施例 中得到的化合物后，培养基在515nm处的OD读数，由测得的OD值，通过如下公式计 算待测样品对人肝癌细胞株(SMMC-7721)、肺腺癌细胞株(A549)细胞、人急性早幼粒白 血病(HL-60)和正常小鼠角质细胞(Pam212)的抑制率：

以被测样品浓度对抑制率做线性回归，求出其48h内的半数抑制浓度(IC₅₀)。以顺铂作 为阳性对照。本发明所获得的代表化合物的IC₅₀结果列于表14中。

表14：本发明所获得的代表化合物的IC₅₀结果

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视 为本发明的保护范围。