BRAF基因检测物在制备ACTH型垂体腺瘤分子病理诊断及分型产品中的应用

摘要

本发明公开了一种BRAF基因检测物在制备ACTH型垂体腺瘤分子病理诊断及分型产品中的应用。实验证明：BRAF基因突变为ACTH型垂体腺瘤所特有，其他类型的垂体腺瘤中未见该基因突变，可作为ACTH型垂体腺瘤一个特异性的分子病理诊断标记物。根据BRAF基因是否突变可进一步将ACTH垂体腺瘤分为两种亚型，即BRAF突变型和野生型，前者平均体积偏小，侵袭度小，午夜血清皮质醇浓度小于或等于22ug/dl；后组平均体积偏大，侵袭度大，午夜血清皮质醇浓度大于22ug/dl。因此可以通过检测BRAF基因是否突变判断ACTH垂体腺瘤的不同亚型，从而及时采取不同的临床治疗策略。

说明书

技术领域

本发明涉及BRAF基因检测物在制备ACTH型垂体腺瘤分子病理诊断及分型产品中的应 用，属于生物技术领域。

背景技术

垂体瘤(Pituitaryadenomas)是人体最常见的神经内分泌性肿瘤，也是最常见的脑肿瘤 之一(发病率占第2位)。按其不同的内分泌特性，可分为泌乳素型、生长激素型、促肾上腺 皮质激素型，促甲状腺激素型、无激素型以及混合型等若干亚型。肿瘤通过异常分泌各种激 素，导致患者出现不孕不育、肢端肥大、Cushing综合症、甲亢等显著的内分泌紊乱症状。垂 体瘤发病隐匿，生长缓慢，当患者出现临床症状前往就诊时，肿瘤往往已体积巨大，呈侵袭 性生长，压迫邻近重要解剖结构，导致患者出现垂体功能低下、双眼视力下降和颅神经麻痹 等神经功能缺失症状，严重影响患者的生活质量，甚至危及生命。

促肾上腺皮质激素(ACTH)型垂体腺瘤系由垂体腺中的促肾上腺皮质激素细胞分泌大 量的ACTH，促进肾上腺分泌大量的皮质醇，最终导致内源性血皮质醇增多症，继而产生一 系列的代谢紊乱和病理变化，特称之为库欣病(Cushing’sdiease)，数量占ACTH依赖性库欣 综合征的85％。库欣病是一种严重的内分泌疾病，极少自行缓解，若不及时诊治，病死率很 高。该病患者主要表现为向心性肥胖，高血压，心血管疾病，代谢紊乱综合征，骨质疏松等。 虽然库欣病的分子发病机制已被广泛研究，但ACTH产生过剩的致病遗传机制仍然不明确。 目前垂体瘤的临床治疗以手术切除为主，药物和立体定向放疗为辅，但只有少数患者通过这 些方法获得治愈，大多数经治病例在较短的症状缓解期后出现肿瘤复发。因此临床上噬待新 的治疗方法。此外，发现ACTH型垂体腺瘤可呈现截然不同的影像学表现及临床表型：部分 肿瘤体积微小，且病灶呈弥散状分布，手术前定位非常困难；而部分肿瘤体积巨大，同时向 周边侵袭性生长，手术中极难获得肿瘤全切除。推测它们可能分属于ACTH型垂体瘤两种不 同的亚型，对其应该采取不同的临床治疗策略。目前尚无特异性的分子诊断标记物可将它们 进行鉴别诊断。

发明内容

本发明的一个目的是提供检测BRAF基因是否发生突变的物质的新用途。

本发明提供了检测BRAF基因是否发生突变的物质在制备检测或辅助检测待测ACTH型 垂体腺瘤患者肿瘤亚型的产品中的应用。

上述应用中，所述BRAF基因的核苷酸序列为序列1。

上述应用中，所述检测BRAF基因是否发生突变的物质包括如下1)或2)或3)：

1)扩增所述BRAF基因的引物；

2)含有所述1)的PCR试剂组；

3)含有所述1)或所述2)的试剂盒；

所述扩增所述BRAF基因的引物为引物对1和/或引物对2；

所述引物对1由序列2所示的单链DNA和序列3所示的单链DNA组成；

所述引物对2由序列4所示的单链DNA和序列5所示的单链DNA组成。

本发明的另一个目的是提供一种检测BRAF基因是否发生突变的物质。

上述物质中，所述检测BRAF基因是否发生突变的物质包括如下1)或2)或3)：

1)扩增所述BRAF基因的引物；

2)含有所述1)的PCR试剂组；

3)含有所述1)或所述2)的试剂盒；

所述扩增所述BRAF基因的引物为引物对1或引物对2；

所述引物对1由序列2所示的单链DNA和序列3所示的单链DNA组成；

所述引物对2由序列4所示的单链DNA和序列5所示的单链DNA组成。

本发明还有一个目的是提供一种检测或辅助检测待测ACTH型垂体腺瘤患者肿瘤亚型的 试剂盒。

本发明提供的检测或辅助检测待测ACTH型垂体腺瘤患者肿瘤亚型的试剂盒包括上述物 质中的引物对1或引物对2。

上述试剂盒还包含数据处理装置；所述数据处理装置内设模块；所述模块具有如下功能： 根据待测患者肿瘤组织中的BRAF基因是否发生突变确定所述待测患者为ACTH型垂体腺瘤 突变型还是ACTH型垂体腺瘤野生型，若待测患者肿瘤组织中的BRAF基因发生突变，则待 测患者为或候选为ACTH型垂体腺瘤突变型；若待测患者肿瘤组织中的BRAF基因未发生突 变，则待测患者为或候选为ACTH型垂体腺瘤野生型；

所述BRAF基因的序列如序列表中序列1所示；

所述ACTH型垂体腺瘤突变型患者的BRAF基因全长或部分片段序列与序列表中序列1 所示的BRAF基因全长或部分片段不完全一致；

所述ACTH型垂体腺瘤野生型患者的BRAF基因全长或部分片段序列与序列表中序列1 所示的BRAF基因全长或部分片段完全一致；

所述BRAF基因的部分片段序列为序列表中序列1的第19200-19609位或序列表中序列 1的第19221-19444位。

上述应用或物质或试剂盒中，ACTH垂体腺瘤的两种亚型：肿瘤午夜血清皮质醇浓度大 于22ug/dl为野生亚型，野生亚型的肿瘤体积小，且病灶呈弥散状分布；肿瘤午夜血清皮质醇 浓度小于或等于22ug/dl为突变亚型，突变亚型的部分肿瘤体积巨大，同时向周边侵袭性生长。 突变亚型为BRAF基因野生型发生突变得到的基因。

上述应用或物质或试剂盒中，所述突变共有两种突变方式：第1种突变方式为将序列表 中序列1所示的BRAF基因的第19324位核苷酸分子由A突变为T(杂合突变)；第2种突变 方式为将序列表中序列1所示的BRAF基因的第19324位核苷酸分子由A突变为T(纯合突 变)。

本发明的最后一个目的是提供一种检测或辅助检测待测ACTH型垂体腺瘤患者肿瘤亚型 的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测ACTH型垂体腺瘤患者肿瘤亚型的方法是检测待测患 者肿瘤组织中的BRAF基因是否发生突变，根据待测患者肿瘤组织中的BRAF基因是否发生 突变确定所述待测患者为ACTH型垂体腺瘤突变型还是ACTH型垂体腺瘤野生型，

若待测患者肿瘤组织中的BRAF基因发生突变，则待测患者为或候选为ACTH型垂体腺 瘤突变型；

若待测患者肿瘤组织中的BRAF基因未发生突变，则待测患者为或候选为ACTH型垂体 腺瘤野生型；

所述ACTH型垂体腺瘤突变型患者的BRAF基因全长或部分片段序列与序列表中序列1 所示的BRAF基因全长或部分片段不完全一致；

所述ACTH型垂体腺瘤野生型患者的BRAF基因全长或部分片段序列与序列表中序列1 所示的BRAF基因全长或部分片段完全一致。

上述方法中，所述检测待测患者肿瘤组织中的BRAF基因是否发生突变的方法为如下A) 或B)：

A)直接测序；

B)用能够扩增所述BRAF基因的引物扩增所述待测患者的基因组DNA。

上述方法中，所述扩增所述BRAF基因的引物为引物对1和/或引物对2；

所述引物对1由序列2所示的单链DNA和序列3所示的单链DNA组成；

所述引物对2由序列4所示的单链DNA和序列5所示的单链DNA组成。

本发明的实验证明：BRAF基因突变为ACTH型垂体腺瘤所特有，其他类型的垂体腺瘤 中未见该基因突变，可作为ACTH型垂体腺瘤一个特异性的分子病理诊断标记物。根据BRAF 基因是否突变可进一步将ACTH垂体腺瘤分为两种亚型，即BRAF突变型(BRAF基因突变) 和野生型(BRAF基因未突变)，前者平均体积偏小，侵袭度小，午夜血清皮质醇浓度小于或 等于22ug/dl；后组平均体积偏大，侵袭度大，午夜血清皮质醇浓度大于22ug/dl。因此可以通 过检测BRAF基因是否突变判断ACTH垂体腺瘤的不同亚型，从而及时采取不同的临床治疗 策略。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、BRAF基因是否突变在辅助鉴定ACTH型垂体腺瘤亚型中的应用

对9例ACTH型垂体腺瘤的肿瘤与自身血样本DNA进行全外显子测序对比分析(测序 仪为IlluminaHiseq2500)，结果在2例肿瘤中出现BRAF基因突变，肿瘤体积小，另外7例 肿瘤中的BRAF基因为野生型，肿瘤体积大；因此将ACTH垂体腺瘤分为两种亚型：ACTH 垂体腺瘤野生型和ACTH垂体腺瘤突变型。

将9例样本经Sanger验证排除假阳性后，在另外149例ACTH型垂体腺瘤(来源于复旦 大学附属华山医院，患者均知情同意)中进行BRAF基因基因型检测，共149例样本的检测 方法具体如下：

首先根据BRAF基因(核苷酸序列为序列表中序列1)设计用于扩增其的引物对，共2 对引物对，每对引物对均能扩增BRAF基因部分片段(其中引物对1的扩增产物为序列表中 序列1的第19200-19609位；引物对2的扩增产物为序列表中序列1的第19221-19444位)， 引物对具体序列如下：

引物对1：1PrimerForward：5’-AGTAACTCAGCAGCATCTCAGG-3’(序列2)；1Primer Reverse：5’-ACACATTTCAAGCCCCAAAA-3’(序列3)；

引物对2：2PrimerForward：5’-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3’(序列4)；2Primer Reverse：5’-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3’(序列5)。

以上述149例肿瘤患者肿瘤的基因组DNA为模板，分别用上述引物对1和引物对2进 行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR扩增体系如表1所示：

表1、扩增体系

组分 终浓度 体积(μL) ddWater 6.4 2X Taq PCR Master Mix 1X 10 Primer F 400nM 0.8 Primer R 400nM 0.8 DNA 1ng/μL 2 Total 20

PCR反应条件如表2所示：

表2、反应条件

对获得的所有引物的PCR产物分别测序，结果发现：BRAF基因的(未突变的野生型BRAF 基因核苷酸序列为序列表中序列1)体细胞变异与ACTH型垂体腺瘤密切相关，具体结果如 下：

在总共149例肿瘤中，发现有23例肿瘤存在BRAF基因突变(15.44％)，共有2种突变 类型：第1种突变方式为将序列表中序列1所示的BRAF基因的第19324位核苷酸分子由A 突变为T(杂合突变)，第2种突变方式为将序列表中序列1所示的BRAF基因的第19324位 核苷酸分子由A突变为T(纯合突变)。其中，14例患者为第1种突变方式；9例患者为第2 种突变方式。

BRAF突变型患者中肿瘤平均直径为1.171cm，午夜血清皮质醇浓度均值9ug/ul，手术全 切率100％，其中，呈侵袭性生长肿瘤的比例为4.35％；BRAF野生型患者，该组肿瘤的平均 直径为1.014cm，午夜血清皮质醇浓度均值41.17ug/ul，手术全切率88％，其中，呈侵袭性生 长肿瘤的比例为13.49％。

因此，可以通过BRAF基因是否发生突变检测或辅助检测待测ACTH型垂体腺瘤患者的 肿瘤亚型，具体方法如下：

检测待测ACTH型垂体腺瘤患者肿瘤中BRAF基因或其部分片段序列，

若所述待测ACTH型垂体腺瘤患者肿瘤中BRAF基因全长或其部分片段序列与BRAF基 因野生型全长序列或对应部分片段序列不一致，则待测ACTH型垂体腺瘤患者肿瘤为或候选 为ACTH型垂体腺瘤突变型；若所述待测ACTH型垂体腺瘤患者肿瘤中BRAF基因全长或其 部分片段序列与所述BRAF基因野生型全长序列或对应部分片段序列一致，则待测ACTH型 垂体腺瘤患者肿瘤为或候选为ACTH型垂体腺瘤野生型；

ACTH型垂体腺瘤野生型的BRAF基因的核苷酸序列为序列表中序列1。

上述检测待测ACTH型垂体腺瘤患者肿瘤中BRAF基因或其部分片段序列方法如下：

1)直接测序待测ACTH型垂体腺瘤患者肿瘤中BRAF基因或其部分片段序列；

2)用引物对1和引物对2分别扩增待测ACTH型垂体腺瘤患者肿瘤中BRAF基因不同 部分片段；

引物对1由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分 子组成；

引物对2由序列表中序列4所示的单链DNA分子和序列表中序列5所示的单链DNA分 子组成。

实施例2、BRAF基因是否突变在辅助鉴定ACTH型垂体腺瘤亚型中的应用

对150例已经经过病理检测的非ACTH型垂体腺瘤患者(包括无激素型、泌乳素型、生 长激素型各50例)肿瘤和实施例1的149例ACTH型垂体腺瘤患者(来源于复旦大学附属 华山医院，患者均知情同意)肿瘤进行BRAF基因突变检测，具体方法如下：

提取各垂体腺瘤患者肿瘤的基因组DNA，用实施例1的引物对1和引物对2分别进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物，并对其进行测序。

测序结果如下：150例非ACTH型垂体腺瘤患者肿瘤的PCR扩增产物的核苷酸序列均与 序列1所示的BRAF基因全长或其部分片段序列一致，150例非ACTH型垂体腺瘤患者肿瘤 均为ACTH型垂体腺瘤野生型；

实施例1的149例ACTH型垂体腺瘤患者中22例患者的PCR扩增产物的核苷酸序列与 序列1所示的BRAF基因全长或其部分片段序列不一致，为ACTH型垂体腺瘤突变亚型患者， 占到总数的15.83％。

因此，可以通过BRAF基因是否发生突变辅助检测待测垂体腺瘤患者肿瘤的ACTH型垂 体腺瘤亚型，具体方法如下：

检测待测垂体腺瘤患者肿瘤中BRAF基因全长或其部分片段序列与BRAF基因野生型全 长序列或对应部分片段序列不一致，则待测垂体腺瘤患者肿瘤候选为ACTH型垂体腺瘤突变 亚型；若所述待测垂体腺瘤患者肿瘤中BRAF基因全长或其部分片段序列与BRAF基因野生 型全长序列或对应部分片段序列一致，则待测垂体腺瘤患者肿瘤候选为ACTH型垂体腺瘤野 生型；BRAF基因野生型序列为序列表中序列1。

上述方法中，辅助检测待测垂体腺瘤患者肿瘤中BRAF基因或其部分片段序列方法如下：

1)直接测序待测垂体腺瘤患者肿瘤中BRAF基因或其部分片段序列；

2)用引物对1和引物对2分别扩增待测垂体腺瘤患者肿瘤中BRAF基因不同部分片段；

引物对1由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分 子组成；

引物对2由序列表中序列4所示的单链DNA分子和序列表中序列5所示的单链DNA分 子组成。