柔嫩艾美耳球虫5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶基因的克隆、原核表达及酶活性分析

摘要

旨在克隆柔嫩艾美耳球虫5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(EtDXR)基因,初步分析EtDXR的酶活性.根据EuPathDB数据库信息注释、拼接Etdxr基因序列,设计特异性引物扩增Etdxr基因,构建原核表达质粒pCold I-EtDXR,转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE及Western blot分析,纯化rEtDXR,对rEtDXR进行酶活性分析,测定pH和Mg2+离子浓度对酶活性的影响.结果显示,Etdxr基因完整编码序列为1 746bp,氨基酸序列具有与其他物种高度保守的酶活性中心;成功构建原核表达质粒pCold I-EtDXR,SDS-PAGE以及Western blot分析显示,得到约50 ku的蛋白质;利用直接检测底物NADPH消耗速率的方法分析EtDXR酶活性,结果显示,不同pH和离子浓度对EtDXR的酶活性有显著影响,其最佳的酶反应条件为pH 7.0,Mg2+离子浓度4.5 mmol·L-1.本研究为进一步以EtDXR为药靶筛选抗球虫先导化合物奠定了基础.