一种“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑猪的制备方法

摘要

本发明公开了一种“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑猪的制备方法。本发明提供的方法，为对目的猪基因组的MSTN基因外显子3中的靶点区域进行基因组编辑，使外显子3提前形成终止密码子而终止表达，得到“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑猪。本发明的方法制备的“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑猪相对于其它突变类型(不形成移码突变或不形成提前终止密码子)的基因编辑而言，可以提前形成终止密码子，对于MSTN基因的修饰更为有效。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编 辑猪的制备方法。

背景技术

肌肉生成抑制素(Myostatin,MSTN)作为一种肌肉生长的负性调控因子，其突变 可引起肌细胞的增生和肥大，从而造成肌肉质量的增加。另外，由于它是一个肌肉发 育特定因子，对它进行的基因工程操作不会影响其他组织，因此，在农业、渔业、畜 牧业和医药等很多方面都有广泛的应用前景和商业价值。

我国是世界猪肉消费第一大国，许多育种学家致力于高瘦肉率的猪种的培育工作。 对自然筛选培育出的比利时蓝牛的测序发现，其MSTN基因外显子3中，保守的生物活性 区11bp的缺失造成了双肌现象。该发现为家畜的育种工作提供了新的思路，即：通过 基因组编辑技术结合体细胞核移植等方法，制备出“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基 因编辑家畜。

近年来兴起的锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases,ZFN)、转录激活子样效应因 子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases,TALEN)和成簇规律 间隔短回文重复与Cas9蛋白(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)等基因组编辑技术，可以在靶位点切割DNA双链，诱发 细胞内源性修复机制，通过同源重组修复或非同源末端连接途径，从而提高了基因的 敲除、定点整合和替换效率。相较于传统的基因打靶技术，其基因编辑效率大大提高， 且由于不带筛选标记，具有更高的安全性。近年来，这些新型的技术已经在猪，牛， 羊等多种家畜中实现其基因组的定点修饰，肉品质、生长速度、抗病能力等关键生产 性状的基因改良也取得了一定的突破。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备“仿比利时蓝牛”MSTN基因型转基因细胞的方 法。

本发明提供的方法，为对目的动物离体成纤维胎儿细胞基因组的MSTN基因外显 子3中的靶点区域进行基因组编辑，使外显子3提前形成终止密码子而终止表达，得 到“仿比利时蓝牛”MSTN基因型转基因细胞；

所述靶点区域为序列1自5’末端第847-899位的核苷酸。

上述方法中，所述基因组编辑通过CRISPR、TALEN或ZFN进行。

上述方法中，所述基因组编辑通过TALEN进行，采用TALEN进行基因组编辑对应 的切割区域为序列1自5’末端第863-882位核苷酸。

上述基因组编辑的方法包括如下步骤：

(1)将重组质粒pcs2-TALE-peas-1L和重组质粒pcs2-TALE-peas-1R共转染目 的动物离体成纤维胎儿细胞中，得到单克隆细胞；

所述重组质粒pcs2-TALE-peas-1L为表达特异识别序列1自5’末端第847-862 位核苷酸的蛋白的质粒，其为将序列2所示的DNA分子通过NheI和Spe I酶切位点连 入pCS2-FokI载体得到的重组载体；

所述重组质粒pcs2-TALE-peas-1R为表达特异识别序列1自5’末端第883-899 位核苷酸的蛋白的质粒，其为将序列3所示的DNA分子通过NheI和Spe I酶切位点连 入pCS2-FokI载体得到的重组载体。

(2)用于扩增MSTN基因切割区域的引物对对所述单克隆细胞进行PCR扩增，检 测PCR扩增产物，选取扩增产物中含有突变型MSTN基因对应的单克隆细胞为含有“仿 比利时蓝牛”MSTN基因型细胞；即为“仿比利时蓝牛”MSTN基因型转基因细胞。

所述“仿比利时蓝牛”MSTN基因型为野生型MSTN基因第3外显子提前形成终止 密码子得到的基因型；

所述突变型MSTN基因为野生型MSTN基因的切割区域中插入1+3n或者缺失2+3n 个碱基数得到的基因；n为大于等于1的整数；

所述野生型MSTN基因的切割区域为序列1自5’末端第863-882位核苷酸。

所述野生型MSTN基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

上述方法中，所述用于扩增MSTN基因切割区域的引物对由序列2所示的单链DNA 分子和序列3所示的单链DNA分子组成。

上述方法中，所述动物为哺乳动物，具体为猪，所述猪的品种尤其具体为陆川猪、 五指山猪、大白猪或梅山猪。

本发明的另一个目的是提供一种制备“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑动 物的方法。

本发明提供的方法，为将上述方法制备的所述含有“仿比利时蓝牛”MSTN基因型 的成纤维胎儿细胞通过体细胞核移植获得“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑动 物。

本发明的第三个目的是提供一种提高动物背肌的肌纤维面积的方法。

本发明提供的方法，为将上述方法制备的所述含有“仿比利时蓝牛”MSTN基因型 的成纤维胎儿细胞通过体细胞核移植，得到的“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编 辑动物，其背肌的肌纤维面积大于野生型动物，实现提高动物背肌的肌纤维面积。

上述方法中，所述动物为哺乳动物，具体为猪，所述猪的品种尤其具体为陆川猪、 五指山猪、大白猪或梅山猪。。

本发明的实验证明，本发明采用TALEN的方法对目的猪基因组的MSTN基因外显 子3中的靶点区域进行基因组编辑，使外显子3提前形成终止密码子而终止表达，得 到“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑猪。“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因 编辑猪相对于其它突变类型的基因编辑(不形成移码突变或不形成提前终止密码子) 而言，可以提前形成终止密码子，对于MSTN基因的修饰更为有效。传统方法制备的 MSTN基因敲除猪，一般采用含正负筛选标记的置换型载体，缺失了大片段的基因，而 本方法制备的基因编辑猪，相对于传统而言，能做到精确修饰，对目的基因进行微修 饰，因而不会对克隆猪个体产生不良影响，且不带外源标记，安全高效。

附图说明

图1为35日龄的胎儿

图2为铺板6天时的克隆

图3为“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑梅山猪、大白猪

图4为55天基因编辑梅山猪背肌HE染色结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

猪野生型MSTN基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

“仿比利时蓝牛”MSTN基因型为MSTN基因的切割区域(序列1自5’末端第 863-882位核苷酸)中插入1+3n或者缺失2+3n个碱基数得到的突变型，导致MSTN基 因第3外显子提前形成终止密码子，形成“仿比利时蓝牛”MSTN基因型。

针对猪MSTN基因的外显子3设计TALEN质粒对，每个质粒上均含有特异性识别 DNA碱基的模块，例如NI识别A，DN识别C，NN识别G，NG识别T，并且在载体的3’ 端含有一个FokI酶，这个酶只有在两条TALEN质粒都识别并锚定到特应性区域后，才 能发挥作用。

这两个质粒转染细胞后，转录翻译后，识别特定的位点，FokI酶开始对中间的序 列进行切割，在没有外源性的同源模板的情况下，会介导DNA的非同源末端连接修复 (nonhomologous end joining,NHEJ)，即将断开的两端序列重新进行连接；在有外源 性的同源模板的情况下，会介导DNA的同源重组修复(homology directed repair, HDR)，从而实现目的基因的精确修饰。

实施例1、“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑猪的制备

一、含有“仿比利时蓝牛”MSTN基因型细胞的制备

1、离体猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblast，PEF)的获得

将不同品种猪的35胎龄胚胎(图1)，去除胎儿的头、尾、四肢、内脏和骨头， 并将血液清理干净。用弯头眼科剪持续剪切胎儿30min保证充分剪碎，将剪碎的胎儿 组织用剪头的蓝枪头吸取到15mL离心管中，加入5mL全培养基，自然沉降数分钟后除 去上面溶液，并在下层组织块中加入几滴FBS，用尖端1cm处弯曲的15cm玻璃巴氏管 吸出，平铺于两个T75培养瓶中，瓶底朝上放置，并在对侧加入15mL全培养液，于 6-8h后小心翻转培养瓶，将组织块浸入培养液中，每两天换一次液，待细胞长满T75 培养瓶后冻存备用，得到离体猪胎儿成纤维细胞(PEF)。

2、含有“仿比利时蓝牛”MSTN基因型细胞的获得

1)质粒转入PEF细胞获得单克隆细胞

针对猪MSTN基因的外显子3设计TALEN质粒对pcs2-TALE-peas-1L和 pcs2-TALE-peas-1R。

将序列2所示的DNA分子通过NheI和Spe I酶切位点连入pCS2-FokI载体(载 体购自康为世纪，货号为：CWBIO Cat No.CW2273)，从而获得重组质粒 pcs2-TALE-peas-1L，该重组质粒进入细胞后，其翻译蛋白可以特异识别序列1自5’ 末端第847-862位核苷酸。

将序列3所示的DNA分子通过NheI和Spe I酶切位点连入pCS2-FokI载体载体 (载体购自康为世纪，货号为：CWBIO Cat No.CW2273)，从而获得重组质粒 pcs2-TALE-peas-1R，该重组质粒进入细胞后，其翻译蛋白可以特异识别序列1自5’ 末端第883-899位核苷酸。

采用电转的方法将2.5ug重组质粒pcs2-TALE-peas-1L和2.5ug重组质粒 pcs2-TALE-peas-1R通过电转化的方式共转染1×10⁶G1代(原代细胞传代后的第一代 细胞称为G1代细胞)的PEF细胞，得到重组细胞。电转严格按照试剂盒和核转仪说明 书操作。电转后，将得到的重组细胞30℃培养72小时，然后收集细胞。对细胞进行 稀释，每个10cm培养皿铺一定数量的细胞，每2-3天换一次培养基。图2为铺板6 天时的克隆。

铺板约10天后，细胞单克隆开始形成，收集每个单克隆一半的细胞量用于基因组 提取，剩下的细胞继续培养。

2)鉴定含有“仿比利时蓝牛”MSTN基因型细胞

设计用于扩增切割区域的引物对如下：

MSTN up：5’-ttgctactattaactcttctttca-3’(序列2)；

MSTN dn：5’-tatattatttgttctttgccatta-3’(序列3)。

将提取上述1)得到的各单克隆细胞的基因组DNA作为模板，用MSTN up与MSTN dn 组成的引物对进行PCR扩增。

回收约370bp的PCR扩增产物并测序，该产物涵盖MSTN基因的部分内含子2和部 分外显子3。

选取扩增产物中含有突变型MSTN基因的单克隆细胞为含有“仿比利时蓝牛”MSTN 基因型细胞，其中，突变型MSTN基因为野生型MSTN基因的切割区域(序列1自5’ 末端第863-882位核苷酸)中插入1+3n或者缺失2+3n个碱基数得到的突变型基因。

不同品种猪的含有突变型MSTN基因的单克隆细胞中对应的突变区域具体序列如 下：

陆川1号猪17号克隆：

TTTGAAGGCTTTTGGATGGGACTGGATTATTGCACCCAAAAGATATAAGGCCAATTACTG

五指山猪27号克隆：

TTTGAAGGCTTTTGGATGGGACTGGATTATTGCACCCAAAAGATATAAGGCCAATTACTG

陆川2号猪85号克隆：

TTTGAAAGCTTTTGGATGGGACTGGATTATTGCACCCAAAAGATATAAGGCCAATTACTG

陆川2号猪193号克隆：

TTTGAAAGCTTTTGGATGGGACTGGATTATTGCACCCAAAAGATATAAGGCCAATTACTG

标准序列(正常MSTN序列对应的位点，对应序列1自5’末端第868-927位核苷 酸)：tttgaa-gcttttggatgggactggattattgcacccaaaagatataaggccaattactg

可以看出，与标准序列相比，上述品种猪对应的序列均为插入1+3n个碱基的突 变型序列，为对目的猪基因组的MSTN基因外显子3中的靶点区域(序列1自5’末端 第847-899位的核苷酸)采用TALEN进行基因组编辑，切割区域为序列1自5’末端 第863-882位核苷酸，使外显子3提前形成终止密码子而终止表达。

陆川2号猪201号克隆：

TTT--AGCTTTTGGATGGGACTGGATTATTGCACCCAAAAGATATAAGGCCAATTACCGC

陆川2号猪214号克隆：

TTTGAAG-----GGATGGGACTGGATTATTGCACCCAAAAGATATAAGGCCAATTACTGC

大白猪16号克隆：

TTTGAAG-----GGATGGGACTGGATTATTGCACCCAAAAGATATAAGGCCAATTACTGC

大白猪166号克隆：

TTTTTT--TTTTGGATGGGACTGGATTATTGCACCCAAAAGATATAAGGCCAATTACTGC

大白猪92号克隆：

TT--AA---T TTGGATGGGACTGGATTATTGCACCCAAAAGATATAAGGCCAATTACTGC

大白猪96号克隆：

TT--AA---T TTGGATGGGACTGGATTATTGCACCCAAAAGATATAAGGCCAATTACTGC

大白猪79号克隆：

T-----------GGGTGGGACTGGATTATTGCACCCAAAAGATATAAGGCCAATTACTGC

梅山75号克隆：

tttga--cttttggatgggactggattattgcacccaaaagatataaggccaattactgc

五指山猪46号克隆：

TTT-AA-CTTTTGGATGGGACTGGATTATTGCACCCAAAAGATATAAGGCCAATTACTGC

标准序列：

tttgaagcttttggatgggactggattattgcacccaaaagatataaggccaattactgc，对应序列 1自5’末端第868-927位核苷酸

可以看出，与标准序列相比，上述品种猪对应的序列均为缺失2+3n个碱基的突变 型序列，为对目的猪基因组的MSTN基因外显子3中的靶点区域(序列1自5’末端第 847-899位的核苷酸)采用TALEN进行基因组编辑，切割区域为序列1自5’末端第 863-882位核苷酸，使外显子3提前形成终止密码子而终止表达。

二、利用体细胞核移植技术构建“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑猪

1、体细胞核移植获得“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑猪

收集大白猪母猪的卵巢，剪下后放入28℃～35℃的含青霉素和硫酸链霉素的生理 盐水中，在2h内运回实验室，以PBS冲洗卵巢，用配有18号针头的10mL一次性注射 器抽取卵泡液。在体式显微镜下，用吸卵吸管挑选细胞质均匀，卵丘细胞包裹2层以 上的卵丘细胞-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte-complexes,COCs)，转移至卵母细胞 成熟培养液中，于5％CO₂，39℃细胞培养箱中培养42～44h。成熟培养42h后，除去卵 丘细胞。以DPBS洗涤3遍后备用。

将上述一制备的得到的不同品种猪的含有突变型MSTN基因的单克隆细胞，于5％ CO₂，39℃，饱和湿度的细胞培养箱培养，待细胞长至对数生长期时，即可用于核移植 操作。

待卵母细胞体外培养成熟后，采用机械盲吸法去除细胞核，用采用电融合法将含 有突变型MSTN基因的单克隆细胞进行体细胞核移植，并在24h之内进行胚胎移植，制 备不同品种的“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑猪(图3)。

2、“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑猪的鉴定

1)分子鉴定

采取少量“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑猪的耳组织样提取基因组DNA 作为模板，用MSTN up与MSTN dn组成的引物对进行PCR扩增，并克隆测序，鉴定克 隆猪的基因型。

测序结果表明，为对目的猪基因组的MSTN基因外显子3中的靶点区域(序列1 自5’末端第847-899位的核苷酸)采用TALEN进行基因组编辑，切割区域为序列1 自5’末端第863-882位核苷酸，使外显子3提前形成终止密码子而终止表达；所获 得的克隆猪为“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑猪。

梅山75号克隆：

tttga--cttttggatgggactggattattgcacccaaaagatataaggccaattactgc

大白猪79号克隆：

T-----------GGGTGGGACTGGATTATTGCACCCAAAAGATATAAGGCCAATTACTGC

标准序列：

tttgaagcttttggatgggactggattattgcacccaaaagatataaggccaattactgc，对应序列

1自5’末端第868-927位核苷酸

2)表型鉴定

选择55天的“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑梅山猪(梅山75)的背肌 进行苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosinstaining,HE)染色。

实验重复3次，结果取平均值。

结果如图4所示，A为单等位基因编辑梅山猪背肌的HE切片图，B为野生型梅山 猪背肌的HE切片图，C为肌纤维面积统计结果，可以看出，该基因编辑猪背肌的肌纤 维面积较相同日龄的野生型梅山猪有较大的提高。

进一步证明其为“仿比利时蓝牛”猪，而且为猪背肌的肌纤维面积增加的猪。