III期NSCLC治疗和与治疗相关的病理状况缓解

摘要

本公开内容总体上涉及采用双功能融合蛋白的靶向的TGF‑β抑制的剂量方案，该剂量方案用于治疗诊断为III期非小细胞肺癌(NSCLC)的未经治疗的对象，和/或缓解与化疗和放疗(cCRT)相关的病理状况的方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年6月13日提交的美国临时专利申请第62/684,385号；于2019年2月4日提交的美国临时专利申请第62/800,808号；于2019年5月31日提交的美国临时专利申请第62/855,170号的权益和优先权，其全部公开内容通过引用纳入本文。

序列表

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技术领域

本公开内容总体上涉及采用双功能融合蛋白的靶向的TGF-β抑制的剂量方案，该剂量方案用于治疗诊断为III期非小细胞肺癌(NSCLC)的未经治疗的对象，和/或缓解与化疗和放疗(cCRT)相关的病理状况的方法。

背景技术

用化疗和并行放疗(cCRT)治疗局部晚期、不可切除的III期NSCLC通常不能控制NSCLC患者的疾病进展。此外，放疗引起病理状况，例如肺纤维化。在开始治疗后的最初6个月内，以≥20Gy的剂量照射肺组织时，可能会发生放射诱导的肺纤维化。

TGFβ是主要的促纤维化分子，有助于肺纤维化的发展。美国专利申请公开号US20150225483 A1，其通过引用纳入本文，描述了一个双官能团融合蛋白，结合抗程序性死亡配体1(PD-L1)抗体及作为TGFβ中和“阱”的肿瘤生长因子贝塔受体II型(TGFβRII)胞外可溶性域为一个单分子。具体地，该蛋白是一个异四聚体，由抗-PD-L1的两条免疫球蛋白轻链和两个重链构成，两条重链包含抗-PD-L1重链和通过柔性甘氨酸-丝氨酸接头与之基因融合的人TGFβRII胞外域(见图1)。此抗-PD-L1/TGFβ阱分子被设计为靶向肿瘤微环境中的两个主要免疫抑制机制。美国专利申请公开号US20150225483A1记载了按照基于患者体重的剂量进行该阱分子的给药。

本公开提供了采用抗PD-L1/TGFβ阱分子的用于靶向TGF-β抑制的剂量方案，其用于治疗被诊断为III期NSCLC的未经治疗的对象和/或缓解与并行cCRT相关的病理状况(例如，肺纤维化，肺炎)的方法。

发明概述

为了对诊断为III期NSCLC的患者进行有效治疗，并应对由于纤维化引起的急性和长期症状性肺损伤，本发明提供了一种治疗III期NSCLC的治疗方案，并尽可能多地保留了正常肺组织免于放射引起的损伤，从而改善NSCLC患者的疾病预后和总体生存率。

一方面，本公开提供了抗PD-L1/TGFβ阱，其具有相伴的cCRT，以同时靶向两种免疫抑制途径：PD-L1和TGF-β，从而治疗III期NSCLC，同时使与相伴的放疗相关的病理状况(例如肺纤维化，肺炎)发展最小化，并且增加患者III期NSCLC的转移开始时间和/或向远处转移的时间。

本公开提供了改进的给药方案，用于给予靶向PD-L1和TGFβ的双功能蛋白以治疗III期NSCLC，同时最小化与相伴的放疗相关的病理状况(例如，肺纤维化，肺炎)的发展，并且增加患者III期NSCLC的转移开始时间和/或向远处转移的时间。具体地，涉及以不同的给药频率给药的至少500mg(例如1200mg，1800mg，2400mg)的双功能蛋白的给药的体重独立(非BW依赖性)给药方案和相关剂型可以用作抗肿瘤和抗癌疗法，用于治疗III期NSCLC，同时将与相伴的放疗相关的病理状况(例如，肺纤维化，肺炎)的发展最小化，并且增加患者的III期NSCLC的转移开始时间和/或向远处转移的时间。非BW依赖性给药方案确保所有III期NSCLC患者，无论其体重如何，都在肿瘤部位有足够的药物暴露。

本公开的双功能蛋白(抗PD-L1/TGFβ阱分子)包括第一和第二多肽。所述第一多肽包括：(a)能够结合人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体的至少重链可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段(例如可溶性片段)。第二多肽包括：能够结合PD-L1的抗体的至少轻链可变区，其中，第一多肽的重链和第二多肽的轻链在组合时形成能结合PD-L1的抗原结合位点(例如，本文所述的任何抗体或抗体片段)。由于本公开的双功能蛋白能与两个靶标结合：(1)PD-L1，其大多与膜结合，和(2)TGFβ，其在血液和间质中为可溶形式，非BW依赖性给药方案需要不仅能在肿瘤位点抑制PD-L1且能足以抑制TGFβ的剂量。

一方面，本公开提供了采用双功能融合蛋白的靶向的TGF-β抑制的剂量方案，该剂量方案用于治疗诊断为III期非小细胞肺癌(NSCLC)的未经治疗的对象，和/或缓解与化疗和放疗(cCRT)相关的病理状况的方法。

一方面，本公开提供了采用双功能融合蛋白的靶向的TGF-β抑制的剂量方案，该剂量方案用于治疗表现出鳞状或非鳞状组织学的III期非小细胞肺癌，和/或缓解与化疗和放疗(cCRT)相关的病理状况的方法。在某些实施方式中，III期NSCLS是不可切除的。

在一个方面，本发明提供了一种通过与cCRT(例如，基于铂的放化疗)联合向患者给予本发明的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗患者的晚期不可切除的III期NSCLC的方法，其中在cCRT之后向患者给予所述抗PD-L1/TGFβ阱。在某些实施方式中，本公开提供了一种治疗患者的晚期不可切除的III期NSCLC的方法，该方法通过以下方式进行：给予患者抗PD-L1/TGFβ阱，联合且跟随(in combination with and following)并行的(concurrent)基于铂的放化疗(chemoradiation)。

在某些实施方式中，cCRT以顺铂/依托泊苷，顺铂/培美曲塞或卡铂/紫杉醇与放射(例如，通过强度调制放疗递送的放射)并行给药。

在某些实施方式中，本发明提供了一种治疗患者的晚期不可切除的III期NSCLC的方法，所述患者具有非鳞状组织学，所述方法通过以下方式进行：向患者给予抗PD-L1/TGFβ阱，其与cCRT联合(例如，顺铂/培美曲塞和放疗)，随后向患者给予抗PD-L1/TGFβ阱。在某些实施方式中，本公开提供了一种治疗患者的晚期不可切除的III期NSCLC的方法，所述方法通过以下方式进行：向患者给予抗PD-L1/TGFβ阱，其联合且跟随并行的(concurrent)顺铂/培美曲塞和放射(例如，通过强度调制放疗递送的放射)。

本公开还包括一种促进TGFβ局部消减的方法。该方法包括给予上述蛋白质，该蛋白质结合溶液中的TGFβ，结合细胞表面的PD-L1，并将结合的TGFβ带入细胞(例如癌细胞)内。

本公开还包括抑制细胞(例如癌细胞或免疫细胞)中SMAD3磷酸化的方法，该方法包括令肿瘤微环境中的细胞暴露于上述蛋白质。

本公开的其他实施方式和详细内容可见后文。

附图简要说明

图1是抗PD-L1/TGFβ阱分子的示意图，包括一个抗PD-L1抗体与两个TGFβ受体II胞外域(ECD)通过(Gly

图2显示了两步ELISA，显示抗PD-L1/TGFβ阱与PD-L1和TGFβ都结合。

图3显示了抗PD-L1/TGFβ阱诱导IL-2水平的急剧增加。

图4A是显示响应抗PD-L1/TGFβ阱的TGFβ1体内消耗的图。线图表示原初，同种型对照，和三种不同剂量，如图例中所示。图4B是显示响应抗PD-L1/TGFβ阱的TGFβ2体内消耗的图。线图表示原初，同种型对照，和三种不同剂量，如图例中所示。图4C是显示响应抗PD-L1/TGFβ阱的TGFβ3体内消耗的图。线图表示原初，同种型对照，和三种不同剂量，如图例中所示。图4D显示抗PD-L1/TGFβ阱分子对PD-L1的占据支持EMT-6肿瘤系统中的受体结合模型。

图5显示了抗-PD-L1/TGFβ阱分子(抗-PD-L1(mut)/TGFβ)在Detroit 562异种移植模型中的抗肿瘤效力。

图6A是固定剂量(1200mg)对比mg/kg体重剂量(17.65mg/kg)在68kg中位体重模拟群体中的全群体C

图6E是固定剂量(500mg)对比mg/kg体重剂量(7.35mg/kg)在68kg中位体重模拟群体中的全群体C

图7A-7C是显示在与小鼠肿瘤停滞相关的剂量和方案中抗PD-L1/TGFβ阱分子的预测的PK和PD-L1受体占有(“RO”)的图。图7A是显示预测的血浆浓度对比时间的图。图7B是显示PBMC中预测的PD-L1 RO对比时间的图。图7C是显示肿瘤中预测的PD-L1 RO对比时间的图。

图8表示对照小鼠(未治疗)和用抗PD-L1/TGFβ阱分子，放射以及抗PD-L1/TGFβ阱分子和放射治疗的小鼠中与纤维化相关的基因表达特征的箱线图。

图9表示在用放射，抗PD-L1/TGFβ阱分子以及相伴的抗PD-L1/TGFβ阱和放射治疗小鼠之后，Cxcl12，Fap和Cdc6的基因表达特征(基于RNA测序分析)。“对照”代表仍未治疗的小鼠中的基因表达。

图10是实施例3中描述的治疗方案的示意图。病情稳定，部分缓解和完全缓解分别用SD，PR和CR表示。

图11是实施例4中描述的治疗方案的示意图。病情稳定，部分缓解和完全缓解分别用SD，PR和CR表示。

图12A-12C是柱状图，显示了抗PD-L1/TGFβ阱和阱对照，而不是抗PD-L1减少了化疗诱导的纤维化。图12A显示虽然抗PD-L1抗体相对于同种型对照不影响胶原蛋白含量，但是阱对照和抗PD-L1/TGFβ阱治疗均显著降低了胶原蛋白含量(总胶原蛋白(苦味红百分比(PSR))；PSR染色是一种常用的组织学技术，可以使石蜡包埋的组织切片中的胶原蛋白可视化。PSR染色的胶原蛋白在光学显微镜下呈红色))；分别为p＝0.0038和p＝0.0019)。图12B显示，相对于同种型对照，抗PD-L1抗体不影响αSMA的百分数，但阱对照和抗PD-L1/TGFβ阱处理均显著降低了αSMA的百分数(分别为p＝0.0003和p＝0.0013)。图12C是柱状图，显示相对于同型对照治疗，抗PD-L1/TGFβ阱降低了pSmad2/3的比率(p＝0.0006)。

图13A是散点图，显示相对于同种型对照，抗PD-L1/TGFβ阱的单一疗法导致上皮-间质转化(EMT)特征评分降低(p<0.0001)，并且相对于同种型对照，抗PD-L1/TGFβ阱和放疗的组合显著下调了EMT特征评分(p<0.0001)。图13B是散点图，其显示抗PD-L1/TGFβ阱单一疗法也降低了促纤维化基因特征评分，但相对于同型对照，放疗显著提高了促纤维化基因特征评分(p＜0.0001)。此外，将放射与抗PD-L1/TGFβ阱相结合相对于单独放射降低了促纤维化信号特征评分。

图14A描绘了箱线图，其显示了抗PD-L1/TGFβ阱与放疗组合显著降低了ACTA2表达。虽然单独放疗对ACTA2的表达无显著影响，但抗PD-L1/TGFβ阱单一疗法和抗PD-L1/TGFβ阱联合放疗显著降低了4T1模型中的ACTA2表达(分别为p<0.0001和p＝0.0236)。

图14B描绘了箱线图，其显示相对于同种型对照，抗PD-L1/TGFβ阱显著降低了CTGF表达(p＝0.0019)，并且如所期望的，尽管放射治疗增加了CTGF，与放射单一疗法相比，抗PD-L1/TGFβ阱组合显著抵消放疗的影响(P＝0.0024)。

图14C描绘了箱线图，其显示相对于同种型对照，抗PD-L1/TGFβ阱显著降低了FAP表达(p<0.0001)，并且通过抗PD-L1/TGFβ阱与放射的组合进一步降低了放疗情况中观察到的FAP降低(P＝0.0054)。

图15描绘了箱线图，其示出了针对每个肿瘤的多个感兴趣区域(ROI)确定并标准化为ROI区域的α-SMA+像素的数量；每个符号代表单个肿瘤的阳性像素比例。P值通过单向方差分析确定。比例尺，250μm。

图16A-16D是显示抗PD-L1/TGFβ阱治疗降低了小鼠肿瘤中α-SMA表达的图像。相对于同型对照(图16A)，抗PD-L1/TGFβ阱治疗显著降低了α-SMA表达(p<0.0001)(图16B)，而放疗显著提高了α-SMA表达(p＝0.0002)(图16C)。相对于单一放疗，抗PD-L1/TGFβ阱与放疗的组合可显著降低α-SMA表达(p＝0.0001)(图16D)，表明抗PD-L1/TGFβ阱可降低放射诱导的癌症-相关的成纤维细胞(CAF)活性。

图17是实施例6中描述的治疗方案的示意图。病情稳定，部分缓解和完全缓解分别用SD，PR和CR表示。

具体实施方式

“TGFβRII”或“TGFβ受体II”指具有野生型人TGFβ受体2型同种型A序列的多肽(例如NCBI参考序列(RefSeq)登录号NP_001020018(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列),或具有野生型人TGFβ受体2型同种型B序列的多肽(例如NCBI参考序列(RefSeq)登录号NP_003233(SEQID NO:9)的氨基酸序列)，或与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列基本相同的序列。TGFβRII可保留野生型序列TGFβ结合活性的至少0.1％、0.5％、1％、5％、10％、25％、35％、50％、75％、90％、95％或99％。表达的TGFβRII多肽没有信号序列。

“能结合TGFβ的TGFβRII片段”指NCBI RefSeq登录号NP_001020018(SEQ ID NO:8)或NCBI RefSeq登录号NP_003233(SEQ ID NO:9)的任何部分，或与SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9的氨基酸序列基本相同的序列，其长度为至少20(例如至少30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,175,或200)个氨基酸，并维持至少一些野生型受体或对应的野生型片段的TGFβ结合活性(例如至少0.1％,0.5％,1％,5％,10％,25％,35％,50％,75％,90％,95％,或99％)。通常，此类片段是可溶性片段。示例性片段之一是具有SEQ IDNO:10序列的TGFβRII胞外域。

“未经治疗”是指自被诊断出患有III期NSCLC以来未曾接受过针对该疾病的在先全身治疗的对象或患者。在本公开的各实施方式中，未经治疗的患者没有接受过采用抗-PD-1、抗-PD-L1或抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抗体(包括伊匹单抗)、或其他任何特异性靶向T细胞协同刺激或检查点通路的抗体或药物的先前治疗。在本公开的各实施方式中，选择未经治疗的患者进行本发明的一线(1L)治疗。

“PD-L1阳性”或“PD-L1+”表示例如通过Dako IHC 22C3 PharmDx检测或VENTANAPD-L1(SP263)检测测定≥1％PD-L1阳性肿瘤细胞。

“PD-L1高”或“高PD-L1”指PD-L1 IHC 73-10检测(Dako)测定≥80％PD-L1阳性肿瘤细胞，或Dako IHC 22C3 PharmDx检测测定肿瘤比例评分(TPS)≥50％(TPS是IHC 22C3检测相关术语，描述具有部分或完全膜染色(例如PD-L1染色)的活肿瘤细胞百分数)。IHC 73-10和Dako IHC 22C3检测在各自临界值选取相似的患者群。在一些实施方式中，也可用与22C3 PharmDx检测高度相关的VENTANA PD-L1(SP263)检测测定PD-L1高表达水平(见Sughayer等，Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol.,(2018))。

“基本相同”表示多肽与参照氨基酸序列显示至少50％，优选60％、70％、75％或80％，更优选85％、90％或95％，最优选99％的氨基酸序列相同性。比较序列的长度一般至少10个氨基酸，优选至少15个连续氨基酸，更优选至少20、25、50、75、90、100、150、200、250、300或350个连续氨基酸，最好是全长氨基酸序列。

“患者”表示人或非人动物(例如哺乳动物)。“患者”，“对象”，“有需要的患者”和“有需要的对象”在本公开中可互换使用，指患有或易患可通过使用本公开中提供的方法和组合物给药来治疗的疾病或病症的活生物体。

本公开中使用的术语“治疗”、“疗法”或其他语法上的等同形式包括减轻，缓解，改善或预防疾病、病况或症状，预防其他症状，改善或预防症状潜在的代谢原因，抑制疾病或病况，例如，阻止疾病或病况的发展，缓解疾病或状况，引起疾病或状况消退，缓解由疾病或病况引起的状况或停止疾病或病况的症状，并旨在包括预防。该术语还包括实现治疗获益和/或预防获益。治疗获益是指根除或改善所治疗的潜在疾病。此外，通过根除或改善与潜在病症相关的一种或多种生理症状来实现治疗益处，由此在患者中观察到改善，尽管患者仍然可能患有潜在病症。

如本领域中通常理解的那样，在本公开的治疗方案的上下文中使用术语“巩固”。例如，根据美国国家癌症研究所的说法，术语“巩固疗法”是在初始疗法后癌症消失后给予的“治疗”。巩固疗法用于杀死可能留在体内的任何癌细胞。它可能包括放疗，干细胞移植或用杀死癌细胞的药物治疗。也称为强化疗法和缓解后疗法。”https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/consolidation-th erapy，最后访问于2018年6月9日。

术语“无进展生存期”或PFS定义为从随机分组(开始治疗后6周或更长周数可以发生)到第一个有记载的肿瘤进展或没有疾病进展而死亡的时间。术语“总体生存期”定义为从随机分组到任何原因致死的时间。研究人员根据RECIST 1.1版评估无进展生存期，作为预定义的敏感性分析。

本公开中使用的术语“减轻”，“减缓”或“缓解”及其他语法上的等同形式包括减轻，缓解，改善或预防疾病、病况或症状，预防其他症状，改善或预防症状潜在的代谢原因，抑制疾病或病况，例如，阻止疾病或病况的发展，缓解疾病或状况，引起疾病或状况消退，缓解由疾病或病况引起的状况或停止疾病或病况的症状，并旨在包括预防。

“癌症”是指III期(IIIA期，IIIB期和/或IIIC期)非小细胞肺癌(NSCLC)根据其直接且普通含义使用，例如，由美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)所表征。因此，在各种实施方式中，癌症已经扩散至例如原发肿瘤的相同侧上的淋巴结或扩散至与原发肿瘤同一胸部相对侧上的淋巴结。

术语“无法切除”是指无法通过手术去除的癌症。

术语“风险”，“处于风险中”和“风险因素”在此如本领域常规理解的那样使用。例如，风险因素是个体增加患病或受伤可能性的任何属性，特征或暴露。在某些实施方式中，处于患疾病，病症或病状的风险中的人是指该人暴露于有助于或增加该疾病，病症或病状的发生概率的风险因素。

在本公开的整个说明书和权利要求书中，词语“包括”和该词的其他形式，例如“含有”和“包含”，意味着包括但不限于，并且不旨在排除例如其他组分。

“共同给药”和“共同给予”是指本文所述的组合物在给予另外疗法的同时、临近其前或紧接其后给予。本公开的蛋白质和组合物可以单独给予，或者可以与第二、第三或第四治疗剂共同给予患者。共同给予意在包括以单独或组合(多于一种治疗剂)的形式同时或依次给予蛋白质或组合物。

术语“一个(种)”并不意味着限制为单数。在某些实施方式中，术语“一个(种)”可以指复数形式。如本文全文所用的单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代对象，除非文本中另有明确说明。因此，例如，提及“组合物”包括多种这样的组合物，以及单一组合物。

“重建的”制剂是通过将冻干制剂溶解在水性载体中制备的制剂，使得双功能分子溶解在重建的制剂中。重建的制剂适合于对有需要的患者静脉内给药(IV)。

术语“约”是指在制剂的制备以及在疾病或病症的治疗中不改变药物效力的药物浓度或量的任何最小改变。在实施方式中，术语“约”可包括指定数值或数据点的±15％。

本公开中，范围可以表示为从“约”一个具体值开始和/或至“约”另一个具体值终止。当表达这样的范围时，另一方面包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当使用先行词“约”表示数值为近似值时，应理解，具体数值构成了另一个方面。还应理解的是，每个范围的端点值在与另一个端点值相关以及独立于另一个端点值的情况下都是有意义的。还应理解，本公开公开了多个数值，并且每个数值在本公开中除了作为该数值本身公开之外，还作为“约”该具体数值来公开。还应理解，在整个申请中，以多种不同格式提供数据，并且该数据代表了各种终点和起点以及数据点任意组合而成的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应理解为视为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于和等于10和15以及10至15之间。还应理解，也公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。

“等渗”制剂是与人血液具有基本相同的渗透压的制剂。等渗制剂通常具有约250至350mOsmol/KgH

术语“缓冲剂”是指一种或多种组分，当加入到水溶液中，当加入酸或碱时，或在用溶剂稀释时，能够保护溶液免于pH变化。除磷酸盐缓冲液外，还可以使用甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液等，在这种情况下，钠离子、钾离子或铵离子可用作反离子。

“酸”是在水溶液中产生氢离子的物质。“药学上可接受的酸”包括在其配制浓度和方式上无毒的无机和有机酸。

“碱”是在水溶液中产生氢氧根离子的物质。“药学上可接受的碱”包括在其配制浓度和方式上无毒的无机和有机碱。

“冻干保护剂”是当与感兴趣的蛋白质结合时，防止或减少冻干和随后储存时蛋白质的化学和/或物理不稳定性的分子。

“防腐剂”是降低细菌作用的物质，并且可以任选地添加至本文的制剂中。添加防腐剂可以，例如，促进复用(多剂量)制剂的生产。可用防腐剂的示例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵，六甲基氯化铵，苯扎氯铵(烷基苄基二甲基氯化铵的混合物，其中烷基为长链化合物)和苄索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳族醇如苯酚，丁醇和苄醇，对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇，3-戊醇和间甲酚。

“表面活性剂”是含有疏水部分(例如烷基链)和亲水部分(例如羧基和羧酸酯/盐基团)的表面活性分子。可以将表面活性剂添加到本发明的制剂中。适用于本发明制剂的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；脱水山梨糖醇酯和衍生物；曲通(Triton)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；十二烷基-、肉豆蔻酰基-、亚油基-或硬脂基-磺基丁二烯(sulfobetadine)；十二烷基-、肉豆蔻酰基-、亚油基-或硬脂基-肌氨酸；亚油基-，肉豆蔻基-或十六烷基-甜菜碱；月桂酰胺丙基-椰油酰胺丙基-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰氨丙基-，棕榈胺酰丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲基胺；甲基椰油酰基-牛磺酸钠，或甲基油酰基-牛磺酸二钠；和MONAQUAT

根据分子的各种临床前和临床评估的结果，已经开发出了与体重无关的给药方案，该方案涉及对未经治疗的患者给予至少500mg的本文所述的双功能抗PD-L1/TGFβ阱分子。有两项研究调查了该分子的安全性，耐受性和药代动力学，包括评估了从治疗的患者血液中获得的外周血单核细胞上的PD-L1目标占有率，并测量了TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的浓度。这些评估基于来自总共350名对象的数据(实体肿瘤中1，3，10和20mg/kg的剂量递增组，以及选择的肿瘤类型中3mg/kg，10mg/kg，500mg和1200mg的扩展组)。

PK/功效模型(小鼠模型)

还实验确定了抗PD-L1/TGFβ阱分子在肿瘤模型中的功效。用来自EMT-6异种移植体的功效结果建立PK/功效模型。在小鼠中建立的PK模型用于模拟抗PD-L1/TGFβ阱血浆暴露以进行功效实验设置。估测参数见表1。估计的KC50值为55.3μg/mL，该值表示可获得抗PD-L1/TGFβ阱分子最大抗肿瘤活性50％的平均血浆浓度。

该模型的基本诊断图显示没有模型错误。模型预测能够获取肿瘤体积分布。条件加权残差通常以0均值和1方差分布而没有趋势。然后使用PK/功效模型采用不同剂量的人预测浓度-时间曲线来模拟肿瘤生长抑制(TGI)。

表1：EMT-6异种移植小鼠中抗PD-L1/TGFβ阱分子的小鼠PK/功效模型参数

基于PD-L1占用率的效果分析(在小鼠模型中)

使用功效实验，分析了小鼠中的效果并通过肿瘤消退或肿瘤停滞进行分选，并且基于整合PK/RO模型预测了PK和PD-L1受体占用(RO)。该方法表明，要达到肿瘤消退需要40至100μg/mL的抗PD-L1/TGFβ阱分子血浆浓度，该浓度关联瘤内高于95％的PD-L1 RO。达到肿瘤停滞状态需要10至40μg/mL的抗PD-L1/TGFβ阱分子血浆浓度，该浓度关联高于95％的外周PD-L1 RO。

小鼠中的效果分析和预测PK/RO见图7A-7C，其总结了抗PD-L1/TGFβ阱分子在小鼠中的PK/RO/功效。在血浆浓度为40μg/mL时达到95％的PD-L1 RO，预期/估测TGI仅为约65％。将浓度升至高于40μg/mL会导致肿瘤生长抑制的进一步增强。在平均血浆浓度为约100μg/mL时实现95％的肿瘤生长抑制。

基于下面描述的群体PK模型，需要每两周给予一次至少500mg的统一剂量(flatdose)以维持约100μg/mL的平均浓度，需要每两周给予一次约1200mg的统一剂量以维持约100μg/mL的C

在某些实施方式中，向对象给予约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg等)的蛋白质产物，该蛋白质产物具有第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:3，所述第二多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:1。在某些实施方式中，向对象给予约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg等)的蛋白质产物，该蛋白质产物具有第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:35、36和37，所述第二多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:38、39和40。

在某些实施方式中，将约1200mg具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物每两周一次给予对象。在某些实施方式中，将约1800mg具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物每三周一次给予对象。在某些实施方式中，将约1200mg具有包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物每两周一次给予对象。在某些实施方式中，将约1800mg具有包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物每三周一次给予对象。

建立非体重依赖性给药方案

根据临床和临床前数据，已开发出一种新的非体重依赖性给药方案，用于抗PD-L1/TGFβ阱分子的给药，以降低暴露差异，减少给药误差，减少进行剂量准备所需的时间，与mg/kg剂量相比可减少药物浪费，从而促进实现良好的治疗效果。根据一个实施方式，不论患者的体重如何，可以给予至少500mg的统一剂量。根据另一个实施方式，不论患者的体重如何，可以给予至少1200mg的统一剂量。根据另一个实施方式，不论患者的体重如何，可以给予至少1,800mg的统一剂量。根据某些实施方式，不论患者的体重如何，可以给予至少2400mg的统一剂量。通常，这些剂量可以重复给药，例如每两周一次或每三周一次。例如，可以每两周一次给予1200mg的统一剂量，或者可以每三周一次给予1800mg的统一剂量，或者可以每三周一次给予2400mg的统一剂量。

人中的药代动力学(PK)分析取样

通过下述实验提供确定抗PD-L1/TGFβ阱最佳统一剂量的药代动力学分析实例。

在第一剂量开始前和第一剂量后的下列时间点收集用于药代动力学(PK)数据分析的血清样品：在输注后即刻第1天和输注开始后4小时；在第1天输注结束后至少24小时的第2天；以及在第8天和第15天。在第15、29、43天，在给药前、输注结束时和输注结束后2至8小时的选定后续给药时机收集样品。对于第57，71和85天的后续时间点，收集或计划收集给药前样品，然后每6周一次PK取样直至12周，然后每12周一次PK取样。在延展阶段(expansion phase)，进行稀疏PK取样。

上述PK数据用于生成群体PK模型并进行可能的给药方案模拟。将称为全方案模型(full approach model)(见Gastonguay,M.，全协变量模型作为方法的替代方案，依赖于关于协变量效应的推论的统计显著性：方法学和42个案例研究综述(Full Covariate Modelsas an Alternative to Methods Relying on Statistical Significance forInferences about Covariate Effects:A Review of Methodology and 42CaseStudies)，(2011)，第20页，摘要2229)的建模方法应用于由模拟获得的群体模型数据以获得具有以下特征的参数：具有线性消除的二室PK模型，CL，V1和V2的IIV，组合的加和和比例残差，CL和V1的全协变量模型。以下基线协变量包括在最终模型中：年龄，体重，性别，种族，白蛋白，CRP，血小板计数，eGFR，肝损伤，ECOG评分，肿瘤大小，肿瘤类型和生物制剂先前治疗。获得了本公开的蛋白质(例如抗PD-L1/TGFβ阱)的以下药代动力学典型参数估值：清除率(CL)0.0177L/h(6.2％)，中央分布体积(V1))3.64升(8.81％)，外周分布体积(V2)0.513升(25.1％)，室间清除率(Q)0.00219升/小时(17.8％)。CL的患者间差异为22％，V1为20％，V2为135％。体重是CL和V1的相关协变量。为了支持统一给药方法，研究了给药策略对本发明蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱)的接触变动的影响。具体而言，进行模拟以比较暴露分布，采用每两周一次1200mg的统一剂量给药方法，对比每两周一次17.65mg/kg(对应于68kg对象每两周一次1200mg)或每两周一次15mg/kg(对应于80kg对象1200mg)的BW调整给药方案。进行进一步模拟以比较每两周一次500mg统一剂量给药方案对比每两周一次7.35mg/kg(对应于68kg对象每两周一次500mg)的BW调整给药方案的暴露分布。另外，进行模拟以评估以下每三周一次统一剂量：1200mg，1400mg，1600mg，1800mg，2000mg，2200mg，2400mg，2600mg，2800mg，3000mg。

使用以下模拟方法：使用最终PK模型方差-协方差矩阵，从参数估测值的多元正态分布中抽取N＝200组参数估测值。对于每个参数估测，从$OMEGA多变量正态分布中抽取200个IIV估测值，得到总共40000(200×200)个主题。对原始数据集(N＝380)进行重新替换取样生成每种给药方案的40000组匹配的协变量和稳态暴露指标(AUC，C

模拟显示，与固定剂量相比，宽BW范围的基于BW给药的暴露差异略高。图6A和6E分别显示了对于中位体重68kg，17.65mg/kg和1200mg统一剂量或7.35mg/kg和500mg统一剂量的暴露分布的示例。模拟还显示患者群体中四分位体重的暴露分布的相反趋势：低体重患者采用固定剂量具有较高暴露，而高体重患者采用BW调整剂量具有较高暴露。

建立人的有效剂量/给药方案：每2周一次(q2w)给予抗PD-L1/TGFβ阱，二线非小细胞肺癌(2L NSCLC)中的初步剂量-响应

通过下述临床研究来建立抗PD-L1/TGFβ阱的疗效的实例。

一线标准治疗(无预先免疫治疗)后进展且未选择PD-L1的晚期NSCLC患者被随机分配为接受本公开的抗PD-L1/TGFβ阱治疗，剂量为500mg或1200mg(每组n＝40)，每两周一次(q2w)，直到出现疾病进展、不可接受的毒性或试验停止为止。主要目标是根据《实体瘤疗效评估标准1.1版》(RECIST v1.1)中的效果评估标准来评估总体最佳疗效(BOR)。其他目标包括剂量探索和安全性/耐受性评估。肿瘤细胞PD-L1表达水平(Ab克隆73-10(Dako)[>80％＝>50％具有Ab克隆22C3(Dako)])表征为PD-L1<1％，≥1％(PD-L1+)或≥80％(PD-L1-高)。在75例患者中，肿瘤细胞PD-L1的表达可评估。

截至分析时的截止数据，有80名患者接受了抗PD-L1/TGFβ阱治疗，中位时间为11.9周(范围2-66.1)，中位随访时间为51.1周。十名患者仍在接受治疗。研究者评估的经证实的总缓解率(ORR)为23.8％(500mg ORR，20.0％；1200mg ORR，27.5％)，其中，两种剂量水平都观察到18个部分缓解(PR)，而1200mg有1个完全缓解(CR)。如表2所示，观察了不同PD-L1表达水平的临床活性：1200mg在PD-L1+患者中ORR为37.0％，在PD-L1高的患者中为85.7％。最常见的治疗相关不良事件(TRAE)是瘙痒症(20.0％)，斑丘疹(18.8％)和食欲减退(12.5％)。23例患者发生3级TRAE(占28.8％)，2例患者发生4级TRAE。八名患者(500mg，n＝2；1200mg，n＝6)由于TRAE停药。没有发生与治疗相关的死亡。

表2：每2周一次用500mg或1200mg抗PD-L1/TGFβ阱治疗的2L NSCLC患者观察到的响应率

这些结果表明，抗PD-L1/TGFβ阱单一疗法具有良好的耐受性，并且在PD-L1亚组之间都显示出疗效，在PD-L1+和PD-L1高的患者中，1200mg的ORR分别为37.0％和85.7％。鉴于较高PD-L1肿瘤细胞表达情形下响应率显著提高(例如接受1200mg治疗的患者)，作为2L治疗观察到的抗PD-L1/TGFβ阱的这种活性有望在未经治疗的PD-L1-高或PD-L1-非依赖性NSCLC患者中转化或提升作为一线(1L)治疗。

创建了具有各种给药频率的数据方案以允许较低频率的给药和/或允许给药计划与相伴用药相协调。具体地，前述初步群体PK建模和模拟方法被用于模拟各种给药方案的暴露并基于暴露来进行方案之间的比较。

基于这些模拟，对于一般对象，需要每两周给予一次至少500mg的统一剂量以维持约100μg/mL的平均浓度，需要每两周给予一次约1200mg的统一剂量以维持约100μg/mL的C

基于C

TGFβ为癌症靶标

本公开允许通过使用与抗体部分系连的可溶性细胞因子受体(TGFβRII)捕获TGFβ从而在肿瘤微环境中局部降低TGFβ，所述抗体部分靶向某些肿瘤细胞或免疫细胞外表面上的细胞免疫检查点受体。本公开抗体部分的一个例子是针对免疫检查点蛋白的如抗PD-L1。本发明的双功能分子，有时在本文中亦称“抗体-细胞因子阱”，是确实有效的，因为抗受体抗体与细胞因子阱物理连接。由此产生的优势(例如相对于所述抗体和所述受体分开给药)部分归因于细胞因子通过自泌和旁泌作用成为局部环境中的主要作用。抗体部分将细胞因子阱引向肿瘤微环境，细胞因子阱在此可通过中和局部免疫抑制性自泌或旁泌作用而表现得最为有效。此外，当抗体的靶标一旦被抗体结合即被内化，则由此提供了清除细胞因子/细胞因子受体复合物的有效机制。显示了PD-L1的抗体介导的靶标内化作用，抗PD-L1/TGFβ阱显示出与抗PD-L1相似的内化率。与使用抗TGFβ抗体相比，这是一个明显的优势，因为首先抗TGFβ抗体可能不具有完全中和性；其次，抗体可以作为载体来延长细胞因子的半衰期。

事实上，如下所述，由于阻断肿瘤细胞上PD-L1和免疫细胞上PD-1之间相互作用的同时中和肿瘤微环境中TGFβ，抗PD-L1/TGFβ阱的治疗引发了协同抗肿瘤作用。不受理论的束缚，这大概是由于通过同时阻断两种主要的免疫逃逸机制而获得的协同作用，而且肿瘤微环境中的TGFβ被单分子实体耗竭。所述耗竭是通过(1)抗PD-L1靶向肿瘤细胞；(2)肿瘤微环境中的TGFβ自泌/旁泌被TGFβ阱所结合和(3)被结合的TGFβ被PD-L1受体介导的内吞作用所破坏。并且，TGFβRII融合于Fc(IgG的结晶片段)的C末端比将TGFβRII置于Fc的N末端的TGFβRII-Fc强数倍。

TGFβ由于其作为癌症“分子双面体”(“Jekyll and Hyde”)的自相矛盾作用在癌症免疫治疗中曾经是有些质疑的靶标(Bierie等，Nat.Rev.Cancer，2006；6：506-20)。就像其他有些细胞因子，TGFβ活性具有发育阶段和背景依赖性。实际上，TGFβ可以充当肿瘤启动子或肿瘤抑制物，影响肿瘤的发生，发展和转移。TGFβ双重作用的潜在机制尚不清楚(Yang等，Trends Immunol。2010；31：220-227)。尽管已经假设Smad依赖性信号传导介导TGFβ信号传导的生长抑制，而Smad非依赖性信号通路可促进其促肿瘤作用，但也有数据表明Smad依赖性信号通路参与了肿瘤的发展(Yang等，Cancer Res.2008；68：9107-11)。

TGFβ配体和受体都作为治疗靶标被深入研究。有三种配体同种型：TGFβ1、2和3，都是均二聚体。还存在三种TGFβ受体(TGFβR)，称为I，II和III型TGFβR(López-Casillas等人，J Cell Biol.1994；124：557-68)。TGFβRI是信号传导链并但不结合配体。TGFβRII高亲合力地结合配体TGFβ1和3，对TGFβ2则不然。TGFβRII/TGFβ复合物募集TGFβRI形成信号传导复合物(Won等，Cancer Res.1999；59:1273-7)。TGFβRIII是TGFβ与其信号传导受体结合的正向调节物，并以高亲和性结合全部3种TGFβ同种型。在细胞表面上，TGFβ/TGFβRIII复合物结合TGFβRII，然后募集TGFβRI取代TGFβRIII形成信号传导复合物。

尽管三种不同的TGFβ同种型均通过同一受体传导信号，但已知它们在体内具有差异表达模式和不重叠的功能。敲除了三种不同TGF-β同种型的小鼠具有不同的表型，表明它们有许多非代偿行的功能(Bujak等，Cardiovasc Res.2007；74:184-95)。TGFβ1缺失的小鼠有造血和血管生成缺陷，TGFβ3缺失小鼠表现出肺部发育和颚发育缺陷，TGFβ2缺失小鼠表现出各种发育异常，最突出的是多发性心脏畸形(Bartram等，Circulation，2001；103：2745-52；Yamagishi等人，Anat Rec.2012；295：257-67)。此外，TGFβ还在缺血和再灌注损伤后的心肌损伤修复中起重要作用。在成人心脏中，心肌细胞分泌TGFβ作为自泌物维持自发搏动速率。重要的是，心肌细胞分泌的TGFβ的70-85％是TGFβ2(Roberts等，J ClinInvest.1992；90：2056-62)。尽管TGFβRI激酶抑制剂治疗引起心脏毒性问题，但本申请的申请人发现抗PD-L1/TGFβ阱在猴中没有毒性，包括心脏毒性。

中和TGFβ的治疗方法包括采用TGFβ受体的胞外域作为可溶性受体阱和中和抗体。在受体阱捕获方法中，可溶性TGFβRIII似乎是显然的选择，因为它结合所有三种TGFβ配体。然而，TGFβRIII的天然形式是280-330kD的葡糖胺聚糖(GAG)-糖蛋白，具有762个氨基酸残基的胞外域，对于生物治疗开发来说是非常复杂的蛋白质。可在昆虫细胞中产生去GAG的可溶性TGFβRIII并已经显示是有效的TGFβ中和剂(Vilchis-Landeros等Biochem.J.,(2001),355:215)。TGFβRIII的两个独立的结合域(内皮糖蛋白相关和尿调节蛋白相关)可以独立表达，但显示亲和力比可溶性TGFβRIII低20至100倍，中和活性大大降低(Mendoza等，Biochemistry.，2009；48：11755-65)。另一方面中，TGFβRII的胞外域长度仅为136个氨基酸残基，可以25-35kD糖蛋白质的形式生产。重组可溶性TGFβRII还显示以200pM的K

中和TGFβ配体所有三种同种型的另一种方法是筛选泛中和性抗TGFβ抗体，或阻断受体与TGFβ1、2和3结合的抗受体抗体。GC1008是对全部TGFβ同种型特异的人抗体，已进入晚期恶性黑素瘤或肾细胞癌患者的I/II期研究(Morris等，J Clin Oncol 2008；26：9028(会议摘要))。尽管发现该治疗是安全且耐受性良好的，但仅观察到有限的临床疗效，因此在未进一步表征免疫学作用的情况下难以解释抗TGFβ治疗的重要性(Flavell等，Nat RevImmunol。2010；10：554-67)。也有TGFβ同种型特异性抗体进入临床试验。麦特丽珠单抗(Metelimumab)是TGFβ1的特异性抗体，已在预防青光眼手术后瘢痕过多的2期临床试验中；在一项3期研究中，发现TGFβ2特异性抗体勒德立木单抗(lerdelimumab)是安全的，但在改善眼部手术后的瘢痕形成方面无效(Khaw等人，Ophthalmology 2007；114：1822-1830)。阻断受体与全部三种TGFβ同种型结合的抗TGFβRII抗体，例如抗人TGFβRII抗体TR1和抗小鼠TGFβRII抗体MT1，也显示出对小鼠原发性肿瘤生长和转移的一些治疗功效(Zhong等，ClinCancer Res.2010；16:1191-205)。然而，在最近一项抗体TR1(LY3022859)的I期研究中，尽管是预防性治疗，超过25mg的更高剂量(统一剂量)因为细胞因子释放失控被认为不安全(Tolcher等，Cancer Chemother Pharmacol 2017；79:673-680)。迄今为止，绝大多数对TGFβ靶向抗癌治疗的研究，包括通常具有相当毒性的TGFβ信号传导小分子抑制剂，大多数处于临床前阶段，并且抗肿瘤效果非常有限(Calone等,Exp Oncol.2012；34:9-16；Connolly等,Int J Biol Sci.2012；8:964-78)。

本公开的抗体-TGFβ阱是双功能蛋白，其包含能够结合TGFβ的人TGFβ受体II(TGFβRII)的至少部分。在一些实施方式中，TGFβ阱多肽是能够结合TGFβ的2型人TGFβ受体同种型A(SEQ ID NO:8)的可溶性部分。在某些实施方式中，TGFβ阱多肽包含至少SEQ ID NO:8的氨基酸73-184。在某些实施方式中，TGFβ阱多肽包含SEQ ID NO:8的氨基酸24-184。在一些实施方式中，TGFβ阱多肽是能够结合TGFβ的2型人TGFβ受体同种型B(SEQ ID NO:9)的可溶性部分。在某些实施方式中，TGFβ阱多肽包含SEQ ID NO:9的至少氨基酸48-159。在某些实施方式中，TGFβ阱多肽包含SEQ ID NO:9的氨基酸24-159。在某些实施方式中，TGFβ阱多肽包含SEQ ID NO:9的氨基酸24-105。

用治疗性抗体靶向T细胞抑制检查点来去抑制(dis-inhibition)是一个具有深入研究的领域(综述可见Pardoll,Nat Rev Cancer.2012；12:253-264)。方案之一中，抗体部分或其抗原结合片段靶向T细胞上的T细胞抑制哨点受体蛋白，例如：CTLA-4、PD-1、BTLA、LAG-3、TIM-3和LAIR1。另一方案中，抗体部分靶向抗原呈递细胞和肿瘤细胞(它们选择这些反受体中的某些用于它们自身的免疫逃逸)上的反受体(counter-receptor)，例如：PD-L1(B7-H1)、B7-DC、HVEM、TIM-4、B7-H3或B7-H4。

本公开考虑通过其抗体部分或其抗原结合片段靶向T细胞抑制检查点的抗体TGFβ阱来去抑制。为此，申请人测试了TGFβ阱与靶向多种T细胞抑制哨点受体蛋白的抗体(例如抗PD-1、抗PD-L1、抗TIM-3和抗LAG3)联合的抗肿瘤效果。

程序性死亡1(PD-1)/PD-L1轴是肿瘤免疫逃逸的重要机制。长期感应抗原的效应T细胞呈现由PD-1表达为标志的衰竭表型，在这种状态下肿瘤细胞通过上调PD-L1参与进来。另外，在肿瘤微环境中，骨髓细胞，巨噬细胞，实质细胞和T细胞上调PD-L1。阻断该轴可恢复这些T细胞中的效应功能。抗PD-L1/TGFβ阱还结合TGFβ(1、2和3个同种型)，其是在肿瘤微环境中由凋亡性中性粒细胞，髓样抑制细胞，T细胞和肿瘤等细胞产生的抑制性细胞因子。可溶性TGFβRII抑制TGFβ减少了恶性间皮瘤，其方式与CD8+T细胞抗肿瘤作用的增加有关。已经显示，由活化的CD4+T细胞和Treg细胞产生的TGFβ1的缺失可抑制肿瘤生长，并保护小鼠免于自发性癌症。因此，TGFβ对于肿瘤免疫逃逸看来是重要的。

TGFβ对正常上皮细胞具有生长抑制作用，起着上皮细胞稳态调节剂作用，并且在早期癌症发生过程中起着抑瘤作用。随着肿瘤向恶性发展，TGFβ对肿瘤的生长抑制作用由于一种或多种TGFβ通道信号传导成分的突变或致癌性重编程而丧失。一旦失去对TGFβ抑制的敏感性，肿瘤就会继续产生高水平的TGFβ，从而促进肿瘤的生长。TGFβ细胞因子在多种癌症类型中过表达，与肿瘤分期相关。肿瘤微环境中许多类型的细胞都会产生TGFβ，包括肿瘤细胞本身，未成熟的髓样细胞，调节性T细胞和基质成纤维细胞；这些细胞在细胞外基质中共同产生大量的TGFβ储库。TGFβ信号传导通过促进转移，刺激血管生成以及抑制先天性和适应性抗肿瘤免疫力促进肿瘤进展。作为一种广泛的免疫抑制因子，TGFβ直接下调活化的细胞毒性T细胞和NK细胞的效应子功能，并有效诱导原初CD4+T细胞分化为免疫抑制调节性T细胞(Treg)表型。另外，TGFβ使巨噬细胞和嗜中性粒细胞极化为伤口愈合表型，该表型与免疫抑制细胞因子的产生有关。作为一种治疗策略，TGFβ活性的中和具有通过恢复有效的抗肿瘤免疫力，阻断转移和抑制血管生成来控制肿瘤生长的潜力。

在开始治疗后的最初6个月内，以≥20Gy的剂量照射肺组织时，可能会发生放射诱导的肺纤维化。TGFβ是主要的促纤维化分子，有助于肺纤维化的发展。因此，在使用cCRT治疗局部晚期，不可切除的III期NSCLC期间靶向TGFβ可能有助于抵消cCRT的有害作用。

许多肺纤维化病例在发作时无症状，并且肺组织中早期纤维化改变且变化最小，很难与肺部炎症改变区分开。有症状的病例通常涉及慢性炎症，其特征是初始急性炎症后表达高水平的循环性血小板衍生和基础成纤维细胞生长因子，成纤维细胞增殖和迁移，TGFβ释放以及被辐照肺部任何组织学空间(包括血管和肺泡腔)中的胶原蛋白沉积。肺部的这种慢性炎症会导致通气-灌注不匹配，并导致肺部功能(甚至功能状态)恶化成为主要症状。其他症状可能与急性放射性肺炎相似，包括非生产性咳嗽和呼吸困难，尽管这些症状通常在本质上更为慢性。由于病理生理学的时间进程，症状直到放射治疗后数月才出现，并且在治疗后的数年中可能会继续发展。

因此，在对被诊断为III期NSCLC的患者用相伴化疗和放疗进行治疗期间，在治疗开始时尽可能多地保留正常肺免于放射引起的损害是有利的，以避免急性和长期的症状性肺损伤，并用于有效的癌症治疗而言也是如此。

本公开提供了采用抗PD-L1/TGFβ阱分子的用于靶向的TGF-β抑制的剂量方案，其用于治疗被诊断为III期NSCLC的未治疗对象和/或缓解与并行cCRT相关的病理状况(例如，肺纤维化)的方法。正在治疗的III期NSCLC与基线PD-L1表达水平无关。肺纤维化相对于基线的变化通过高分辨率CT扫描和肺功能测试进行测量。

相伴的PD-1和TGFβ阻断可以重建促炎性细胞因子。抗PD-L1/TGFβ阱包括例如：人TGFβ受体TGFβRII的胞外域，其经由甘氨酸/丝氨酸接头共价连接至完全人IgG1抗PD-L1抗体的每条重链的C末端。鉴于抗PD-1/PD-L1类的新兴蓝图，其中响应明显但具有增加效应大小的空间，据信，共同靶向互补免疫调节步骤将改善肿瘤响应。一种类似的TGF-靶向剂弗瑞索单抗(fresolimumab)是一种针对TGFβ1、2和3的单克隆抗体，在一项针对黑素瘤患者的I期试验中显示出了肿瘤疗效的初步证据。

本公开提供实验表明抗PD-L1/TGFβ阱的TGFβRII部分(阱对照“抗-PDL-1(mut)/TGFβ阱”)引起抗肿瘤活性。例如，在Detroit562人咽癌模型中皮下植入后，当以25μg，76μg或228μg的剂量给药时，抗PDL1(mut)/TGFβ阱引起肿瘤体积的剂量依赖性减小(图5)。

本公开提供实验表明本公开的蛋白质同时结合PD-L1和TGFβ(图2)。

本公开提供实验表明，在体外，本公开的蛋白质(例如抗PD-L1/TGFβ阱)抑制PD-L1和TGFβ依赖性信号传导。本公开提供实验，其证明本公开的蛋白质通过阻断PD-L1介导的免疫抑制在体外增强T细胞效应功能，如通过超抗原刺激后的IL-2诱导测定所测量(图3)。在约100ng/ml时，本公开的蛋白质在体外诱导IL-2水平的显著增加(图3)。

本公开提供实验表明，在体内，本公开的蛋白质(例如抗PD-L1/TGFβ阱)引起血液中TGFβ的消减。用55μg，164μg或492μg本公开的蛋白质处理JH小鼠中原位植入的EMT-6乳腺癌细胞有效且特异性地消减TGFβ1(图4A)，TGFβ2(图4B)和TGFβ3(图4C)。此外，本公开内容提供了实验，其证明本公开的蛋白质占据PD-L1靶标，支持本公开的蛋白质契合EMT-6肿瘤系统中的受体结合模型的概念(图4D)。

本公开提供的实验证明，本公开的蛋白质有效地，特异性地且同时与PD-L1和TGFβ结合，在多种小鼠模型中具有强效抗肿瘤活性，抑制了肿瘤的生长和转移，并延长了生存期(例如，生存期长至并包括6个月，12个月，18个月，22个月，28个月，32个月，38个月，44个月，50个月，56个月，62个月，68个月，74个月，80个月，86个月，92个月，98个月，104个月或110个月)，并赋予长期保护性抗肿瘤免疫力。在某些实施方式中，延长的生存期是至少108个月。

抗PD-L1抗体

本公开的抗PD-L1/TGFβ阱分子可以包括本领域中描述的任何抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。抗PD-L1抗体是可购得的，例如29E2A3抗体(Biolegend，批号329701)。抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。抗体片段包括Fab、F(ab’)2、scFv和Fv片段，详见后文。

示例性抗体可见PCT公开文本WO 2013/079174。这些抗体可包含含有HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列的重链可变区多肽，其中：

(a)HVR-H1序列是X

(b)HVR-H2序列是SIYPSGGX

(c)HVR-H3序列是IKLGTVTTVX

并且其中：X

实施方式之一中，X

另一个实施方式中，X

另一个实施方式中，X

另一方面中，所述多肽还包含位于HVR之间的可变区重链框架序列，如下所示：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)。

另一个方面，所述框架序列源自人共有框架序列或人种系框架序列。

另一方面中，所述框架序列至少之一如下所述：

HC-FR1是EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:24)；

HC-FR2是WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:25)；

HC-FR3是RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:26)；

HC-FR4是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。

另一方面中，重链多肽进一步与包括HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的可变区轻链组合，其中：

(a)HVR-L1序列是TGTX

(b)HVR-L2序列是X

(c)HVR-L3序列是SSX

并且其中：X

另一实施方式中，X

另一实施方式中，X

另一方面中，所述轻链还包含位于HVR之间的可变区轻链框架序列，如下所示：(LC-FR1MHVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。

另一方面中，所述轻链框架序列源自人共有框架序列或人种系框架序列。

另一方面中，所述轻链框架序列是λ轻链序列。

另一方面中，所述框架序列至少其一如下所述：

LC-FR1是QSALTQPASVSGSPGQSITISC(SEQ ID NO:31)；

LC-FR2是WYQQHPGKAPKLMIY(SEQ ID NO:32)；

LC-FR3是GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO:33)；

LC-FR4是FGTGTKVTVL(SEQ ID NO:34)。

另一实施方式中，本公开提供抗PD-L1抗体或包含重链和轻链可变区序列的抗原结合片段，其中：

(a)所述重链包括HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，并且其中：(i)HVR-H1序列是X

(b)所述轻链包括HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，并且其中：(iv)HVR-L1序列是TGTX

实施方式之一中，X

另一实施方式中，X

在另一个实施方式中，X

另一方面中，所述重链可变区包含如下所示位于HVR之间的一个或多个框架序列：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)，并且所述轻链可变区包含如下所示位于HVR之间的一个或多个框架序列：(LC-FR1 MHVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。

另一方面中，所述框架序列源自人共有框架序列或人种系序列。

另一方面中，所述重链框架序列中一个或多个如下所述：

HC-FR1是EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:24)；

HC-FR2是WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:25)；

HC-FR3是RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:26)；

HC-FR4是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。

另一方面中，所述轻链框架序列是λ轻链序列。

另一方面中，所述轻链框架序列中一个或多个如下所述：

LC-FR1是QSALTQPASVSGSPGQSITISC(SEQ ID NO:31)；

LC-FR2是WYQQHPGKAPKLMIY(SEQ ID NO:32)；

LC-FR3是GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO:33)；

LC-FR4是FGTGTKVTVL(SEQ ID NO:34)。

另一方面中，重链可变区多肽、抗体或抗体片段还包含至少C

在一更具体的方面中，重链可变区多肽、抗体或抗体片段还包含C

另一方面中，可变区轻链、抗体或抗体片段还包含C

另一方面中，抗体还包括C

另一更具体的方面中，抗体还包含人或鼠恒定区。

在另一个方面中，人恒定区选自下组：IgG1、IgG2、IgG2、IgG3、IgG4。

在一更具体的方面中，人或鼠恒定区是lgG1。

另一实施方式中，本公开包括一种抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链包括HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，它们分别与SYIMM(SEQ ID NO:35)、SIYPSGGITFYADTVKG(SEQ ID NO:36)和IKLGTVTTVDY(SEQ ID NO:37)具有至少80％总体序列相同性，且

(b)所述轻链包括HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，它们分别与TGTSSDVGGYNYVS(SEQ IDNO:38),DVSNRPS(SEQ ID NO:39),和SSYTSSSTRV(SEQ ID NO:40)具有至少80％总体序列相同性。

在一个具体方面，所述序列相同性是81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

另一实施方式中，本公开包括一种抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链包括HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，它们分别与MYMMM(SEQ ID NO:41)、SIYPSGGITFYADSVKG(SEQ ID NO:42)和IKLGTVTTVDY(SEQ ID NO:37)具有至少80％总体序列相同性，且

(b)所述轻链包括HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，它们分别与TGTSSDVGAYNYVS(SEQ IDNO:43),DVSNRPS(SEQ ID NO:39),和SSYTSSSTRV(SEQ ID NO:40)具有至少80％总体序列相同性。

在一个具体方面，所述序列相同性是81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

另一方面中，本公开的抗体或抗体片段中，相比HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3的序列，至少如下所示以下划线突出显示的那些氨基酸保持不变：

(a)在HVR-H1中：S

(b)在HVR-H2中：

(c)在HVR-H3中：

并且其中，相比HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的序列，至少如下所示以下划线突出显示的那些氨基酸保持不变：

(a)HVR-L1 TGTSSDVGGYNYVS(SEQ ID NO:38)

(b)HVR-L2

(c)HVR-L3

另一方面中，所述重链可变区包含如下所示位于HVR之间的一个或多个框架序列：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)，并且所述轻链可变区包含如下所示位于HVR之间的一个或多个框架序列：(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。

另一方面中，所述框架序列源自人种系序列。

另一方面中，所述重链框架序列中一个或多个如下所述：

HC-FR1是EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:24)；

HC-FR2是WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:25)；

HC-FR3是RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:26)；

HC-FR4是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。

另一方面中，所述轻链框架序列源自λ轻链序列。

另一方面中，所述轻链框架序列中一个或多个如下所述：

LC-FR1是QSALTQPASVSGSPGQSITISC(SEQ ID NO:31)；

LC-FR2是WYQQHPGKAPKLMIY(SEQ ID NO:32)；

LC-FR3是GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO:33)；

LC-FR4是FGTGTKVTVL(SEQ ID NO:34)。

另一更具体的方面中，抗体还包含人或鼠恒定区。

在另一个方面中，人恒定区选自下组：IgG1、IgG2、IgG2、IgG3、IgG4。

在某些实施方式中，本公开包括一种抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMVWRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADWKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:44)，并且

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO:45)。

在各种实施方式中，重链序列与SEQ ID NO:44具有至少86％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少86％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少87％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少87％的序列相同性；重链序列与SEQ IDNO:44具有至少88％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少88％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少89％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少89％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少90％的序列相同性，轻链序列与SEQID NO:45具有至少90％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少91％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少91％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少92％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少92％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少93％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少93％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少94％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少94％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少95％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少96％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少96％的序列相同性；重链序列与SEQID NO:44具有至少97％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少97％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少98％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少98％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少99％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含SEQ ID NO:44，轻链序列包含SEQ ID NO:45。

在某些实施方式中，本公开提供一种抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYMMMWVRQAPGKGLE VWSSIYPSGGITFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCAR IKLGTVTTVDYWG QGTLVTVSS(SEQ ID NO:46)，并且

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGAYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO:47)。

在各种实施方式中，重链序列与SEQ ID NO:46具有至少86％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少86％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少87％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少87％的序列相同性；重链序列与SEQ IDNO:46具有至少88％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少88％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少89％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少89％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少90％的序列相同性，轻链序列与SEQID NO:47具有至少90％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少91％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少91％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少92％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少92％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少93％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少93％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少94％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少94％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少95％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少95％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少96％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少96％的序列相同性；重链序列与SEQID NO:46具有至少97％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少97％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少98％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少98％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少99％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含SEQ ID NO:46，轻链序列包含SEQ ID NO:47。

另一实施方式中，所述抗体结合人、小鼠或猕猴PD-L1。在一具体方面中，抗体能够阻断人、小鼠或猕猴PD-L1与相应人、小鼠或猕猴PD-1受体之间的相互作用。

另一实施方式中，抗体以5x10

另一实施方式中，本公开涉及抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其结合包含人PD-L1残基Y56和D61的功能性表位。

在一具体方面中，所述功能性表位还包含人PD-L1的E58、E60、Q66、R113和M115。

在一更具体的方面中，所述抗体结合包含人PD-L1残基54-66和112-122的构象表位。

在某些实施方式中，本公开涉及抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段与本文所述的本公开抗体交叉竞争结合PD-L1。

在某些实施方式中，本公开包括包含任何上述抗PD-L1抗体的蛋白质和多肽，其与至少一种药学上可接受的运载体组合。

在某些实施方式中，本公开包括一种分离的核酸，其编码本文所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的多肽、或轻链或重链可变区序列。在某些实施方式中，本公开提供一种分离的核酸，其编码抗PD-L1抗体的轻链或重链可变区序列，其中：

(a)所述重链包括HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列，它们分别与SYIMM(SEQ ID NO:35)、SIYPSGGITFYADTVKG(SEQ ID NO:36)和IKLGTVTTVDY(SEQ ID NO:37)具有至少80％序列相同性，或

(b)所述轻链包括HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列，它们分别与TGTSSDVGGYNYVS(SEQID NO:38),DVSNRPS(SEQ ID NO:39)和SSYTSSSTRV(SEQ ID NO:40)具有至少80％序列相同性。

在一个具体方面，所述序列相同性是81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

另一方面，重链的核酸序列是：

(SEQ ID NO:48)

并且轻链的核酸序列是：

(SEQ ID NO:49)。

可用于抗PD-L1/TGFβ阱的其它示例性抗-PD-L1抗体可见美国专利申请公开US2010/0203056。本公开的实施方式之一中，抗体部分是YW243.55S70。在另一实施方式中，抗体部分是MPDL3289A。

在某些实施方式中，本公开包括一种抗PD-L1抗体部分，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:12)，且

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:13)

在各种实施方式中，重链序列与SEQ ID NO:12具有至少86％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少86％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少87％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少87％的序列相同性；重链序列与SEQ IDNO:12具有至少88％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少88％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少89％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少89％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少90％的序列相同性，轻链序列与SEQID NO:13具有至少90％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少91％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少91％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少92％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少92％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少93％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少93％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少94％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少94％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少95％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少95％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少96％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少96％的序列相同性；重链序列与SEQID NO:12具有至少97％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少97％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少98％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少98％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少99％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含SEQ ID NO:12，轻链序列包含SEQ ID NO:13。

在某些实施方式中，本公开包括一种抗PD-L1抗体部分，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:14)，且

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:13)

在各种实施方式中，重链序列与SEQ ID NO:14具有至少86％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少86％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少87％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少87％的序列相同性；重链序列与SEQ IDNO:14具有至少88％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少88％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少89％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少89％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少90％的序列相同性，轻链序列与SEQID NO:13具有至少90％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少91％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少91％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少92％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少92％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少93％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少93％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少94％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少94％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少95％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少95％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少96％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少96％的序列相同性；重链序列与SEQID NO:14具有至少97％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少97％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少98％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少98％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少99％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含SEQ ID NO:14，轻链序列包含SEQ ID NO:13。

可用于抗PD-L1/TGFβ阱的其它示例性抗-PD-L1抗体可见美国专利申请公开US2018/0334504。

在某些实施方式中，本公开包括一种抗PD-L1抗体部分，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO:55),和

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:56)。

在各种实施方式中，重链序列与SEQ ID NO:55具有至少86％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少86％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少87％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少87％的序列相同性；重链序列与SEQ IDNO:55具有至少88％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少88％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少89％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少89％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少90％的序列相同性，轻链序列与SEQID NO:56具有至少90％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少91％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少91％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少92％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少92％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少93％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少93％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少94％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少94％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少95％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少95％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少96％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少96％的序列相同性；重链序列与SEQID NO:55具有至少97％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少97％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少98％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少98％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少99％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含SEQ ID NO:55，轻链序列包含SEQ ID NO:56。

在某些实施方式中，本公开包括一种抗PD-L1抗体部分，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:57),和

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:58)。

在各种实施方式中，重链序列与SEQ ID NO:57具有至少86％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少86％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少87％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少87％的序列相同性；重链序列与SEQ IDNO:57具有至少88％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少88％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少89％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少89％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少90％的序列相同性，轻链序列与SEQID NO:58具有至少90％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少91％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少91％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少92％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少92％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少93％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少93％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少94％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少94％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少95％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少95％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少96％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少96％的序列相同性；重链序列与SEQID NO:57具有至少97％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少97％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少98％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少98％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少99％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含SEQ ID NO:57，轻链序列包含SEQ ID NO:58。

在某些实施方式中，本公开包括一种抗PD-L1抗体部分，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO:59),和

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:60)。

在各种实施方式中，重链序列与SEQ ID NO:59具有至少86％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少86％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少87％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少87％的序列相同性；重链序列与SEQ IDNO:59具有至少88％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少88％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少89％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少89％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少90％的序列相同性，轻链序列与SEQID NO:60具有至少90％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少91％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少91％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少92％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少92％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少93％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少93％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少94％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少94％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少95％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少95％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少96％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少96％的序列相同性；重链序列与SEQID NO:59具有至少97％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少97％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少98％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少98％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少99％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含SEQ ID NO:59，轻链序列包含SEQ ID NO:60。

在某些实施方式中，本公开包括一种抗PD-L1抗体部分，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGA(SEQ ID NO:61),和

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:62)。

在各种实施方式中，重链序列与SEQ ID NO:61具有至少86％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少86％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少87％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少87％的序列相同性；重链序列与SEQ IDNO:61具有至少88％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少88％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少89％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少89％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少90％的序列相同性，轻链序列与SEQID NO:62具有至少90％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少91％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少91％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少92％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少92％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少93％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少93％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少94％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少94％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少95％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少95％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少96％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少96％的序列相同性；重链序列与SEQID NO:61具有至少97％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少97％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少98％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少98％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少99％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含SEQ ID NO:61，轻链序列包含SEQ ID NO:62。

可用于抗PD-L1/TGFβ阱的其它示例性抗-PD-L1抗体可见美国专利公开文本US 7,943,743。

在本公开实施方式之一中，抗PD-L1抗体是MDX-1105。

在一些实施方式中，抗PD-L1抗体是MEDI-4736。

恒定区

本公开的蛋白质和肽可包括免疫球蛋白的恒定区或恒定区片段、类似物、变体、突变体或衍生物。在某些实施方式中，恒定区源自人免疫球蛋白重链，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他类。在某些实施方式中，恒定区包括CH2结构域。另些实施方式中，恒定区包括CH2和CH3结合域或包括铰链-CH2-CH3。或者，恒定区可包括全部或部分铰链区、CH2结构域和/或CH3结构域。

实施方式之一中，恒定区包含降低对Fc受体亲和力或降低Fc效应功能的突变。例如，恒定区可包含消除IgG重链恒定区中糖基化位点的突变。一些实施方式中，恒定区含有氨基酸位置对应于IgG1的Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Asn297或Pro331的突变、缺失或插入(氨基酸根据EU命名法编号)。具体实施方式之一中，恒定区在对应于IgG1 Asn297的氨基酸位置含有突变。另一实施方式中，恒定区含有氨基酸位置对应于IgG1的Leu281、Leu282、Gly283、Gly284、Asn344或Pro378的突变、缺失或插入。

一些实施方式中，恒定区含有源自人IgG2或IgG4重链的CH2结构域。优选地，CH2结构域包含消除CH2结构域中糖基化位点的突变。实施方式之一中，突变改变IgG2或IgG4重链CH2结构域内Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO:15)氨基酸序列内的天冬酰胺。优选地，突变将天冬酰胺变成谷氨酰胺。或者，突变改变Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO:15)氨基酸序列内苯丙氨酸和天冬酰胺两者。在实施方式之一中，Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO:15)氨基酸序列被Gln-Ala-Gln-Ser(SEQ ID NO:16)氨基酸序列取代。Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO:15)氨基酸序列内的天冬酰胺对应于IgG1的Asn297。

另一实施方式中，恒定区包括CH2结构域和至少部分铰链区。铰链区可以是源自免疫球蛋白重链例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他类。优选地，铰链区源自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他合适的类。更优选地，铰链区源自人IgG1重链。实施方式之一中，IgG1铰链区Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys(SEQ ID NO:17)氨基酸序列中的半胱氨酸被改变。在某些实施方式中，Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys(SEQ ID NO:17)氨基酸序列被Pro-Lys-Ser-Ser-Asp-Lys(SEQ ID NO:18)氨基酸序列取代。在某些实施方式中，恒定区包括源自第一抗体同种型的CH2结构域和源自第二抗体同种型的铰链区。在某些实施方式中，CH2结构域源自人IgG2或IgG4重链，而铰链区源自经改变的人IgG1重链。

Fc部分与非Fc部分连接处附近的氨基酸改变会显著提高Fc融合蛋白的血清半衰期(PCT公开文本WO 01/58957，其公开内容通过引用纳入本文)。因此，本公开的蛋白质或多肽的连接区可含有相对于免疫球蛋白重链和促红细胞生成素天然序列的改变，优选距连接点约10个氨基酸以内。这些氨基酸改变会引起疏水性增强。实施方式之一中，恒定区源自IgG序列，其中C末端的赖氨酸残基被替换。优选地，IgG序列的C末端赖氨酸被替换成非赖氨酸的氨基酸(例如丙氨酸或亮氨酸)以进一步提高血清半衰期。另一实施方式中，恒定区源自IgG序列，其中，恒定区C末端附近的Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO:19)氨基酸序列具有消除潜在接合性T细胞表位的改变。例如，实施方式之一中，Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO:19)氨基酸序列被Ala-Thr-Ala-Thr(SEQ ID NO:20)氨基酸序列取代。其他实施方式中，Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO:19)段内的氨基酸被例如甘氨酸或脯氨酸等其他氨基酸替换。在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或他类免疫球蛋白分子的C-末端附近产生Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ IDNO:19)段氨基酸取代的方法可详见美国专利公开号20030166877，其公开内容通过引用纳入本文。

本公开的适宜铰链区可源自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其他免疫球蛋白类别。IgG1铰链区有三个半胱氨酸，其中两个参与免疫球蛋白两重链之间的二硫键。这些半胱氨酸使得Fc部分之间二硫键的形成高效且一致。因此，本公开的铰链区之一源自IgG1，例如，人IgG1。优选实施方式中，人IgG1铰链区内的第一个半胱氨酸突变为其他氨基酸，优选丝氨酸。IgG2同种型铰链区有四个二硫键，它们倾向于促成重组系统分泌期间的寡聚化和可能不正确的二硫键。适宜的铰链区可源自IgG2铰链，优选其中前两个半胱氨酸各自突变成其他氨基酸。已知IgG4的铰链区形成链间二硫键不大有效然而，本公开的合适铰链区可以源自IgG4铰链区，优选含有增强重链衍生部分之间正确形成二硫键的突变(Angal S等，(1993)Mol.Immunol.,30:105-8)。

根据本公开，恒定区可包含源自不同抗体同种型的CH2和/或CH3结构域和铰链区，例如杂交(hybrid)恒定区。例如，实施方式之一中，恒定区含有源自IgG2或IgG4的CH2和/或CH3结构域和源自IgG1的突变铰链区。或者，杂交恒定区中可采用源自其他IgG亚类的突变铰链区。例如，可以采用能够有效形成两重链间二硫键的IgG4铰链突变形式。突变型铰链也可源自IgG2铰链，其中前两个半胱氨酸各自突变成其他氨基酸。杂交恒定区的组装可见美国专利公开号20030044423，其公开内容通过引用纳入本文。

根据本公开，恒定区可包含一处或多处本文所述的突变。Fc部分中突变的组合对延长血清半衰期和提高双功能分子体内效力具有累加或协同效应。因此，示例性实施方式之一中，恒定区可包含(i)衍生自IgG序列的区域，其中Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO:19)氨基酸序列被Ala-Thr-Ala-Thr(SEQ ID NO:20)氨基酸序列替换；(ii)C-末端丙氨酸残基代替赖氨酸；(iii)衍生自不同抗体同种型的CH2结构域和铰链区，例如IgG2 CH2结构域和改变的IgG1铰链区；和(iv)消除IgG2衍生的CH2结构域内的糖基化位点的突变，例如IgG2衍生的CH2结构域内的Gln-Ala-Gln-Ser(SEQ ID NO:16)氨基酸序列而不是Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO:15)氨基酸序列。

抗体片段

本公开的蛋白质和多肽还可包括抗体的抗原结合片段。示例性抗体片段包括scFv、Fv、Fab、F(ab’)

单链抗体片段，也称为单链抗体(scFv)，是重组多肽，它们通常结合抗原或受体；这些片段包含用或不用一个或多个互连接头相连的至少一个抗体可变轻链序列(V

单链抗体片段包含具有本文所述完整抗体可变区或CDR中至少其一的氨基酸序列，但缺失那些抗体的全部或部分恒定域。这些恒定域对于抗原结合来说不是必需的，但是构成完整抗体结构的主要部分。因此，单链抗体片段可以克服采用包含部分或全部恒定区的抗体相关的一些问题。例如，单链抗体片段倾向于不在生物分子与重链恒定区之间发生不希望有的相互作用或其他不希望有的生物活性。此外，单链抗体片段比完整抗体小得多，因此可具有比完整抗体更高的毛细血管通透性，这令单链抗体片段能够更高效地寻址并结合至靶抗原结合位点。并且，抗体片段可以在原核细胞中以相对大的规模产生，从而促进其生产。此外，单链抗体片段相对较小使得它们比完整抗体更不会在接受者中引发免疫反应。

还可以有与完整抗体具有相同或相当的结合特征的抗体片段。这样的片段可含有一个或两个Fab片段或F(ab’)

药物组合物

本公开还包括包含治疗有效量的本文所述的蛋白质的药物组合物。所述组合物可配制成适用于多种药物递送系统。组合物中还可包含一种或多种生理学上可接受的赋形剂或运载体以制成合适的制剂。可用于本公开的合适制剂可见《雷明顿药物科学》第17版，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Company)，1985。关于药物递送方法的综述可见例如Langer(Science 249:1527-1533,1990)。

在一个方面，本公开提供了用于未经治疗癌症患者中III期NSCLC癌症治疗或肿瘤生长抑制的方法的静脉内药物递送制剂，其包含500mg-2400mg的包含第一多肽和第二多肽的蛋白质，所述第一多肽包含：(a)能够结合人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体的至少重链可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段，所述第二多肽包含：能够结合PD-L1的抗体的至少轻链可变区，并且第一多肽的重链和第二多肽的轻链在组合时形成能结合PD-L1的抗原结合位点。

在某些实施方式中，本公开的蛋白质产物包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，本公开的蛋白质产物包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ IDNO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列。

在本公开的某些实施方式中，用于在未经治疗癌症患者内治疗III期NSCLC或抑制肿瘤生长的方法的静脉内药物递送制剂可包含约500mg至约2400mg剂量(例如，约500mg至约2300mg，约500mg至约2200mg，约500mg至约2100mg，约500mg至约2000mg，约500mg至约1900mg，约500mg至约1800mg，约500mg至约1700mg，约500mg至约1600mg，约500mg至约1500mg，约500mg至约1400mg，约500mg至约1300mg，约500mg至约1200mg，约500mg至约1100mg，约500mg至约1000mg，约500mg至约900mg，约500mg至约800mg，约500mg至约700mg，约500mg至约600mg，约600mg至2400mg，约700mg至2400mg，约800mg至2400mg，约900mg至2400mg，约1000mg至2400mg，约1100mg至2400mg，约1200mg至2400mg，约1300mg至2400mg，约1400mg至2400mg，约1500mg至2400mg，约1600mg至2400mg，约1700mg至2400mg，约1800mg至2400mg，约1900mg至2400mg，约2000mg至2400mg，约2100mg至2400mg，约2200mg至2400mg，或约2300mg至2400mg)的本公开内容的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ IDNO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含约500-2000mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含约500mg剂量的包含第一多肽和第二多肽的本公开的蛋白质产物，其中第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含500mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含约1,200mg剂量的包含第一多肽和第二多肽的本公开的蛋白质产物，其中第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，且第二多肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含1200mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含约1800mg剂量的包含第一多肽和第二多肽的本公开的蛋白质产物，其中第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含1800mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含1800mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含约2400mg剂量的包含第一多肽和第二多肽的本公开的蛋白质产物，其中第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含2400mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含2400mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽))。

在某些实施方式中，用于未经治疗癌症患者中III期NSCLC治疗或肿瘤生长抑制的方法的静脉内药物递送制剂可包含约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg至约3000mg，约1200mg至约2900mg，约1200mg至约2800mg，约1200mg至约2700mg，约1200mg至约2600mg，约1200mg至约2500mg，约1200mg至约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约3000mg，约1400mg至约3000mg，约1500mg至约3000mg，约1600mg至约3000mg，约1700mg至约3000mg，约1800mg至约3000mg，约1900mg至约3000mg，约2000mg至约3000mg，约2100mg至约3000mg，约2200mg至约3000mg，约2300mg至约3000mg，约2400mg至约3000mg，约2500mg至约3000mg，约2600mg至约3000mg，约2700mg至约3000mg，约2800mg至约3000mg mg，约2900mg至约3000mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg，约2500mg，约2600mg，约2700mg，约2800mg，约2900mg或约3000mg)的本公开的蛋白质产物(例如抗PD-L1/TGFβ阱)。在某些实施方式中，用于未经治疗癌症患者中III期NSCLC治疗或肿瘤生长抑制的方法的静脉内药物递送制剂可包含约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg至约3000mg，约1200mg至约2900mg，约1200mg至约2800mg，约1200mg至约2700mg，约1200mg至约2600mg，约1200mg至约2500mg，约1200mg至约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约3000mg，约1400mg至约3000mg，约1500mg至约3000mg，约1600mg至约3000mg，约1700mg至约3000mg，约1800mg至约3000mg，约1900mg至约3000mg，约2000mg至约3000mg，约2100mg至约3000mg，约2200mg至约3000mg，约2300mg至约3000mg，约2400mg至约3000mg，约2500mg至约3000mg，约2600mg至约3000mg，约2700mg至约3000mg，约2800mg至约3000mg mg，约2900mg至约3000mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg，约2500mg，约2600mg，约2700mg，约2800mg，约2900mg或约3000mg)的蛋白质产物，其具有包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包括SEQ IDNO:1的氨基酸序列的第二多肽；或具有包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物。

在某些实施方式中，用于未经治疗癌症患者中III期NSCLC治疗或肿瘤生长抑制的方法的静脉内药物递送制剂可包含约525mg，约550mg，约575mg，约600mg，约625mg，约650mg，约675mg，约700mg，约725mg，约750mg，约775mg，约800mg，约825mg，约850mg，约875mg，约900mg，约925mg，约950mg，约975mg，约1000mg，约1025mg，约1050mg，约1075mg，约1100mg，约1125mg，约1150mg，约1175mg，约1200mg，约1225mg，约1250mg，约1275mg，约1300mg，约1325mg，约1350mg，约1375mg，约1400mg，约1425mg，约1450mg，约1475mg，约1500mg，约1525mg，约1550mg，约1575mg，约1600mg，约1625mg，约1650mg，约1675mg，约1700mg，约1725mg，约1750mg，约1775mg，约1800mg，约1825mg，约1850mg，约1875mg，约1900mg，约1925mg，约1950mg，约1975mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg或约2400mg的本公开的蛋白质(例如，抗-PD-L1/TGFβ阱)，其包含具有SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和具有SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽。

用于在未经治疗的癌症患者中治疗III期NSCLC或抑制肿瘤生长的方法中的本公开的静脉内药物递送制剂可以包含在袋，笔或注射器中。在某些实施方式中，袋可以连接包括管和/或针的通道。在某些实施方式中，制剂可以是冻干制剂或液体制剂。在某些实施方式中，制剂可以冷冻干燥(冻干)并包含在约12-60个小瓶中。在某些实施方式中，制剂可以是冷冻干燥的，并且约45mg的冷冻干燥制剂可以包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，约40mg-约100mg的冷冻干燥制剂可以包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，将来自12，27或45个小瓶的冷冻干燥制剂合并以获得静脉内药物制剂中治疗剂量的蛋白质。在某些实施方式中，制剂可以是蛋白质产物的液体制剂，该产物具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽；或具有包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物，并储存为约250mg/小瓶至约2000mg/小瓶(例如，约250mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1900mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1800mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1700mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1600mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1500mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1400mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1300mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1200mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1100mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1000mg/小瓶，约250mg/小瓶至约900mg/小瓶，约250mg/小瓶至约800mg/小瓶，约250mg/小瓶至约700mg/小瓶，约250mg/小瓶至约600mg/小瓶，约250mg/小瓶至约500mg/小瓶，约250mg/小瓶至约400mg/小瓶，约250mg/小瓶至约300mg/小瓶，约300mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约400mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约500mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约600mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约700mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约800mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约900mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1000mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1100mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1200mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1300mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1400mg/小时小瓶至约2000mg/小瓶，约1500mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1600mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1700mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1800mg/小瓶至约2000mg/小瓶，或约1900mg/小瓶至约2000mg/小瓶)。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约600mg/小瓶。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约1200mg/小瓶。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约1800mg/小瓶。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约2,400mg/小瓶。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约250mg/小瓶。

本公开提供了液体水性药物制剂，其于缓冲溶液中包含治疗有效量的本公开的蛋白质(例如，抗-PD-L1/TGFβ阱)而形成制剂，该制剂用于未经治疗癌症患者中III期NSCLC治疗或肿瘤生长抑制的方法。

这些用于未经治疗癌症患者中III期NSCLC治疗或肿瘤生长抑制的方法的组合物可用常规灭菌技术灭菌或可进行无菌过滤。所得水性溶液可包装成原样使用(“use as-is”)型产品或冻干，冻干制剂在给药之前与无菌水性运载体合并。制剂的pH通常在3至11之间，5至9之间或6至8之间更好，7至8之间例如7至7.5之间最好。得到的固体形式的组合物可以包装成多个单剂量单位，每个单剂量单位含有固定量的上述一种或多种药剂。固体形式的组合物也可以包装在容器中以获得灵活的量。

在某些实施方式中，本公开提供了用于未经治疗癌症患者中III期NSCLC治疗或肿瘤生长抑制的方法的具有延长的保质期的制剂，所述制剂包括本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽))和甘露醇，柠檬酸一水合物，柠檬酸钠，二水合磷酸氢二钠，二水合磷酸二氢钠，氯化钠，聚山梨醇酯80，水和氢氧化钠。

在某些实施方式中，本公开用于未经治疗癌症患者中III期治疗或肿瘤生长抑制的方法的水性制剂制备成在pH缓冲溶液中包含本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽)；或具有包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物。本发明的缓冲液的pH可以为约4至约8，例如约4至约8，约4.5至约8，约5至约8，约5.5至约8，约6至约8，约6.5至约8，约7至约8，约7.5至约8，约4至约7.5，约4.5至约7.5，约5至约7.5，约5.5至约7.5，约6至约7.5，约6.5至约7.5，约4至约7，约4.5至约7，约5至约7，约5.5至约7，约6至约7，约4至约6.5，约4.5至约6.5，约5至约6.5，约5.5至约6.5，约4至约6.0，约4.5至约6.0，约5至约6，或约4.8至约5.5，或可具有约5.0至约5.2的pH。上述pH的中间范围也是本公开的一部分。例如，旨在包括使用任何上述值的组合作为上限和/或下限的值范围。将pH控制在该范围内的缓冲剂的示例包括乙酸盐(例如乙酸钠)，琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)，葡糖酸盐，组氨酸，柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂。

在某些实施方式中，用于未经治疗癌症患者中癌症III期NSCLC治疗或肿瘤生长抑制的方法的制剂包括含有柠檬酸盐和磷酸盐、将pH维持在约4至约8的范围内的缓冲系统。在某些实施方式中，pH范围可以为约4.5至约6.0，或约pH4.8至约5.5，或在约5.0至约5.2的pH范围内。在某些实施方式中，缓冲系统包括柠檬酸一水合物，柠檬酸钠，二水合磷酸氢二钠和/或二水合磷酸二氢钠。在某些实施方式中，缓冲系统包含约1.3mg/ml的柠檬酸(例如，1.305mg/ml)，约0.3mg/ml的柠檬酸钠(例如，0.305mg/ml)，约1.5mg/ml的二水合磷酸氢二钠(例如，1.53mg/ml)，约0.9mg/ml的二水合磷酸二氢钠(例如，0.86)，和约6.2mg/ml的氯化钠(例如，6.165mg/ml)。在某些实施方式中，缓冲系统包含约1-1.5mg/ml的柠檬酸，约0.25至约0.5mg/ml的柠檬酸钠，约1.25至约1.75mg/ml的二水合磷酸氢二钠，约0.7至约1.1mg/ml的二水合磷酸二氢钠，和6.0至6.4mg/ml的氯化钠。在某些实施方式中，用氢氧化钠调节制剂的pH。

用作调理剂并可稳定抗体的多元醇也可包括在制剂中。多元醇加入到制剂中的量可以根据制剂的所需等渗性而不同。在某些实施方式中，水性制剂可以是等渗的。加入的多元醇的量也可以相对于多元醇的分子量而改变。例如，与二糖(例如海藻糖)相比，可以加入较低量的单糖(例如甘露醇)。在某些实施方式中，可以在制剂中用作张力剂的多元醇是甘露醇。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约5至约20mg/ml。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约7.5至约15mg/ml。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约10至约14mg/ml。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约12mg/ml。在某些实施方式中，制剂中可包含多元醇山梨糖醇。

清洁剂或表面活性剂也可以加入到制剂中。示例性清洁剂包括非离子清洁剂，例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20，80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。加入的清洁剂的量使得它减少配制的抗体的聚集和/或使制剂中颗粒的形成最小化和/或减少吸附。在某些实施方式中，制剂可包括表面活性剂聚山梨醇酯。在某些实施方式中，制剂可含有清洁剂聚山梨醇酯80或吐温80。吐温80用于表示聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(参见Fiedler，《辅料百科》(Lexikon der Hilfsstoffe)，Editio Cantor Verlag Aulendorf出版，第4版，1996)。在某些实施方式中，制剂可含有约0.1mg/mL至约10mg/mL，或约0.5mg/mL至约5mg/mL的聚山梨醇酯80。在某些实施方式中，可以在制剂中加入约0.1％的聚山梨醇酯80。

冻干制剂

本公开的用于未经治疗癌症患者中III期NSCLC治疗或肿瘤生长抑制的方法的冻干制剂包含抗PD-L1/TGFβ阱分子和冻干保护剂。冻干保护剂可以是糖，例如二糖。在某些实施方式中，冻干保护剂可以是蔗糖或麦芽糖。冻干制剂还可包含缓冲剂，表面活性剂，填充剂和/或防腐剂中的一种或多种。

可用于稳定冻干药物产品的蔗糖或麦芽糖的量可以是至少1:2的蛋白质与蔗糖或麦芽糖重量比。在某些实施方式中，蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比可以为1:2至1:5。

在某些实施方式中，在冻干之前，可以通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定制剂的pH。在某些实施方式中，药学上可接受的酸可以是盐酸。在某些实施方式中，药学上可接受的碱可以是氢氧化钠。

在冻干之前，含有本公开的蛋白质的溶液的pH可以调节为约6至约8之间。在某些实施方式中，冻干药物产品的pH范围可以为约7至约8。

在某些实施方式中，可以约10mM-约200mM的量加入盐或缓冲组分。盐和/或缓冲剂是药学上可接受的，并且衍生自各种已知酸(无机和有机)与“成碱”金属或胺。在某些实施方式中，缓冲液可以是磷酸盐缓冲液。在某些实施方式中，缓冲液可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液，在这种情况下，钠离子、钾离子或铵离子可以用作反离子。

在某些实施方式中，可以添加“填充剂”。“填充剂”是这样一种化合物，它增加冻干混合物的量并有助于冻干块体的物理结构(例如，有助于生产保持开孔结构的基本上均匀的冻干饼体)。示例性填充剂包括甘露醇，甘氨酸，聚乙二醇和山梨糖醇。本发明的冻干制剂可含有此类填充剂。

可任选地将防腐剂加入本文的制剂中以减少细菌作用。添加防腐剂可以，例如，促进复用(多剂量)制剂的生产。

在某些实施方式中，用于未经治疗癌症患者中III期NSCLC治疗或肿瘤生长抑制的方法的冻干药物产品可以用水性运载体来复溶。本文所关注的水性运载体是药学上可接受的(例如对人给药安全无毒)并且可在冻干后用于制备液体制剂。示例性稀释剂包括无菌注射用水(SWFI)，抑菌性注射用水(BWFI)，pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)，无菌盐水溶液，林格氏溶液或右旋糖溶液。

在某些实施方式中，本公开的冻干药物产品用无菌注射用水，USP(SWFI)或0.9％氯化钠注射液，USP重建。在复溶过程中，冻干粉末溶解成溶液。

在某些实施方式中，本公开的冻干蛋白质产物溶于约4.5mL注射用水并用0.9％盐水溶液(氯化钠溶液)稀释。

液体制剂

一些实施方式中，将本公开的蛋白质产物配制成用于未经治疗癌症患者中III期NSCLC治疗或肿瘤生长抑制的方法的液体制剂。液体制剂可以10mg/mL浓度存在于USP/PhEur I型50R小瓶中，小瓶用橡皮塞封口并用铝卷边包封来密封。塞子可以由符合USP和PhEur的弹性体制成。在某些实施方式中，小瓶可以填充有约61.2mL的蛋白质产物溶液，以允许有60mL的可提取体积。在某些实施方式中，液体制剂可以用0.9％盐水溶液稀释。在某些实施方式中，小瓶可含有约61.2mL的约20mg/mL至约50mg/mL(例如，约20mg/mL，约25mg/mL，约30mg/mL，约35mg/mL，约40mg/mL，约45mg/mL或约50mg/mL)的蛋白质产物(例如抗PD-L1/TGFβ阱)(例如，具有包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物)溶液，以允许有60mL的可提取体积用于递送约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg至约3000mg，约1200mg至约2900mg，约1200mg至约2800mg，约1200mg至约2700mg，约1200mg至约2600mg，约1200mg至约2500mg，约1200mg至约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约3000mg，约1400mg至约3000mg，约1500mg至约3000mg，约1600mg至约3000mg，约1700mg至约3000mg，约1800mg至约3000mg，约1900mg至约3000mg，约2000mg至约3000mg，约2100mg至约3000mg，约2200mg至约3000mg，约2300mg至约3000mg，约2400mg至约3000mg，约2500mg至约3000mg，约2600mg至约3000mg，约2700mg至约3000mg，约2800mg至约3000mg，约2900mg至约3000mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg，约2500mg，约2600mg，约2700mg，约2800mg，约2900mg，或约3000mg)的蛋白质产物(例如抗PD-L1/TGFβ阱，如具有包含SEQ IDNO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物；或具有包含SEQ ID NO:35、36、和37的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物)至对象。

在某些实施方式中，小瓶可含有约61.2mL的约20mg/mL至约50mg/mL(例如，约20mg/mL，约25mg/mL，约30mg/mL，约35mg/mL，约40mg/mL，约45mg/mL或约50mg/mL)的蛋白质产物(例如抗PD-L1/TGFβ阱，如具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQID NO:1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物；或具有包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物)溶液，以允许有60mL的可提取体积用于递送约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg至约3000mg，约1200mg至约2900mg，约1200mg至约2800mg，约1200mg至约2700mg，约1200mg至约2600mg，约1200mg至约2500mg，约1200mg至约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约3000mg，约1400mg至约3000mg，约1500mg至约3000mg，约1600mg至约3000mg，约1700mg至约3000mg，约1800mg至约3000mg，约1900mg至约3000mg，约2000mg至约3000mg，约2100mg至约3000mg，约2200mg至约3000mg，约2300mg至约3000mg，约2400mg至约3000mg，约2500mg至约3000mg，约2600mg至约3000mg，约2700mg至约3000mg，约2800mg至约3000mg，约2900mg至约3000mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg，约2500mg，约2600mg，约2700mg，约2800mg，约2900mg，或约3000mg)的蛋白质产物至未经治疗的对象。

在某些实施方式中，在本公开中用于在未接受治疗的癌症患者中治疗III期NSCLC或抑制肿瘤生长，同时最小化与相伴放疗相关的病理状况(例如，肺纤维化，肺炎)的发展，并增加患者III期NSCLC的转移开始时间和/或向远处转移的时间的方法中使用的液体制剂可以以10mg/mL浓度的溶液与稳定水平的糖组合制备。在某些实施方式中，液体制剂可以制备在水性运载体中。在某些实施方式中，可以加入稳定剂，其加量不大于可能导致粘度对静脉内给药来说不合适或不理想的量。在某些实施方式中，糖可以是二糖，例如蔗糖。在某些实施方式中，液体制剂还可包含缓冲剂、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。

在某些实施方式中，在冻干之前，可以通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定制剂的pH。在某些实施方式中，药学上可接受的酸可以是盐酸。在某些实施方式中，碱可以是氢氧化钠。

除聚集外，脱酰胺是肽和蛋白质的常见产物变体，可发生于发酵、收获/细胞澄清、纯化、药物/药物产品储存期间和样品分析期间。脱酰胺作用是蛋白质中丢失NH

在某些实施方式中，本公开用于未经治疗癌症患者中III期NSCLC治疗或肿瘤生长抑制的方法的液体制剂可以在pH和湿度条件下保存以防止蛋白质产物脱氨基。

本文所关注的水性运载体是药学上可接受的(对人给药安全无毒)并且可用于制备液体制剂。示例性运载体包括无菌注射用水(SWFI)，抑菌性注射用水(BWFI)，pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)，无菌盐水溶液，林格氏溶液或右旋糖溶液。

可任选地将防腐剂加入本文的制剂中以减少细菌作用。添加防腐剂可以，例如，促进复用(多剂量)制剂的生产。

特定情况下，静脉内(IV)制剂可以是优选的给药途径，例如当患者在移植后在医院中通过IV途径接受所有药物时。在某些实施方式中，在给药前用0.9％氯化钠溶液稀释液体制剂。在某些实施方式中，用于注射的稀释药物产品是等渗的并且适于通过静脉内输注给药。

在某些实施方式中，盐或缓冲组分可以约10mM-约200mM的量加入。盐和/或缓冲剂是药学上可接受的，并且衍生自各种已知酸(无机和有机)与“成碱”金属或胺。在某些实施方式中，缓冲液可以是磷酸盐缓冲液。在某些实施方式中，缓冲液可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液，在这种情况下，钠离子、钾离子或铵离子可以用作反离子。

可任选地将防腐剂加入本文的制剂中以减少细菌作用。添加防腐剂可以，例如，促进复用(多剂量)制剂的生产。

本文所关注的水性运载体是药学上可接受的(对人给药安全无毒)并且可用于制备液体制剂。示例性运载体包括无菌注射用水(SWFI)，抑菌性注射用水(BWFI)，pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)，无菌盐水溶液，林格氏溶液或右旋糖溶液。

可任选地将防腐剂加入本文的制剂中以减少细菌作用。添加防腐剂可以，例如，促进复用(多剂量)制剂的生产。

在一个方面，本公开提供了一种在需要治疗的未经治疗的对象中治疗III期NSCLC或抑制肿瘤生长，同时使与相伴放疗相关的病理状况(例如，肺纤维化，肺炎)的发展最小化，并增加在患者中转移开始时间和/或到远距离转移的时间的方法，该方法包括向对象给予至少500mg剂量的蛋白质，该蛋白质包括第一多肽和第二多肽。所述第一多肽包括：(a)能与人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)结合的抗体的至少重链可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段。所述第二多肽至少包括结合PD-L1的抗体轻链可变区，并且第一多肽的重链和第二多肽的轻链在组合时形成能结合PD-L1的抗原结合位点。

在一个方面，本发明提供了一种通过与cCRT(例如，基于铂的化学放射)联合向患者给予抗PD-L1/TGFβ阱来治疗患者的晚期不可切除的III期非小细胞肺癌(NSCLC)，然后向患者给予抗PD-L1/TGFβ阱的方法。在某些实施方式中，本公开提供了一种通过与并行基于铂的化学放射(cCRT)联合并在其后给予患者抗PD-L1/TGFβ阱来治疗患者的晚期不可切除的III期NSCLC的方法。

在某些实施方式中，用顺铂/培美曲塞和放疗(cCRT)与抗PD-L1/TGFβ阱联合治疗的患者被诊断患有晚期不可切除的III期NSCLC，其表现出非鳞状组织学。

在某些实施方式中，cCRT以顺铂/依托泊苷，顺铂/培美曲塞或卡铂/紫杉醇的形式与通过强度调节的放疗递送的60-66Gy(例如60Gy)总放射剂量并行给药。在某些实施方式中，cCRT以顺铂/依托泊苷的形式与通过强度调节的放疗递送的60-66Gy(例如60Gy)总放射剂量并行给药。在某些实施方式中，cCRT以卡铂/紫杉醇的形式与通过强度调节的放疗递送的60-66Gy(例如60Gy)总放射剂量并行给药。在某些实施方式中，cCRT以顺铂/培美曲塞的形式与通过强度调节的放疗递送的60-66Gy(例如60Gy)总放射剂量并行给药。

在某些实施方式中，本公开的治疗III期NSCLC或抑制肿瘤生长的方法包括向未经治疗的对象给予包含两种肽的蛋白质，其中第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，蛋白质是抗PD-L1/TGFβ阱分子。

在一些实施方式中，根据本文公开的方法治疗的未经治疗的对象在用本公开的双功能蛋白(抗PD-1/TGFβ阱分子)治疗前未接受过先前治疗。在一些实施方式中，根据本公开的方法待治疗的未经治疗的癌症患者具有或不具有表皮生长因子受体(EGFR)致敏(激活)突变，间变性淋巴瘤激酶(ALK)易位和/或ROS1突变。

在某些实施方式中，用于治疗III期NSCLC或抑制肿瘤生长，同时最小化与相伴放疗相关的病理状况(例如，肺纤维化，肺炎)的发展，并增加患者中III期NSCLC的转移开始时间和/或向远处转移的时间的方法涉及对未经治疗的对象给予蛋白质(例如抗PD-L1/TGFβ阱(如具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物；或具有包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物))，其剂量为约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg至约3000mg，约1200mg至约2900mg，约1200mg至约2800mg，约1200mg至约2700mg，约1200mg至约2600mg，约1200mg至约2500mg，约1200mg至约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约3000mg，约1400mg至约3000mg，约1500mg至约3000mg，约1600mg至约3000mg，约1700mg至约3000mg，约1800mg至约3000mg，约1900mg至约3000mg，约2000mg至约3000mg，约2100mg至约3000mg，约2200mg至约3000mg，约2300mg至约3000mg，约2400mg至约3000mg，约2500mg至约3000mg，约2600mg至约3000mg，约2700mg至约3000mg，约2800mg至约3000mg mg，约2900mg至约3000mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg，约2500mg，约2600mg，约2700mg，约2800mg，约2900mg或约3000mg)。在某些实施方式中，每两周一次向未经治疗的III期NSCLC对象(例如，不可切除的III期NSCLC对象)给予约1200mg的抗PD-L1/TGFβ阱分子。在某些实施方式中，每三周一次向未经治疗的III期NSCLC对象(例如，不可切除的III期NSCLC对象)给予约1800mg的抗PD-L1/TGFβ阱分子。在某些实施方式中，每两周一次给予未经治疗的对象约1200mg具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物。在某些实施方式中，每三周一次给予未经治疗的III期NSCLC对象(例如，不可切除的III期NSCLC对象)约1800mg具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物。在某些实施方式中，每三周一次给予未经治疗的III期NSCLC对象(例如，不可切除的III期NSCLC对象)约1800mg具有包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物。在某些实施方式中，将约2400mg具有包含SEQID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物每三周一次给予对象。在某些实施方式中，每三周一次给予对象约2400mg具有包含SEQID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物。

在某些实施方式中，给予未经治疗的III期NSCLC对象(例如，不可切除的III期NSCLC对象)的剂量可以是约500mg，约525mg，约550mg，约575mg，约600mg，约625mg，约650mg，约675mg，约700mg，约725mg，约750mg，约775mg，约800mg，约825mg，约850mg，约875mg，约900mg，约925mg，约950mg，约975mg，约1000mg，约1025mg，约1050mg，约1075mg，约1100mg，约1125mg，约1150mg，约1175mg，约1200mg，约1225mg，约1250mg，约1275mg，约1300mg，约1325mg，约1350mg，约1375mg mg，约1400mg，约1425mg，约1450mg，约1475mg，约1500mg，约1525mg，约1550mg，约1575mg，约1600mg，约1625mg，约1650mg，约1675mg，约1700mg，约1725mg，约1750mg，约1775mg，约1800mg，约1825mg，约1850mg，1875mg，约1900mg，约1925mg，约1950mg，约1975mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，或约2400mg。

在某些实施方式中，给予未经治疗的III期NSCLC对象(例如，不可切除的III期NSCLC对象)的剂量可以每两周一次给予。在某些实施方式中，给予未经治疗的III期NSCLC对象(例如，不可切除的III期NSCLC对象)的剂量可以每三周一次给予。在某些实施方式中，蛋白质可以通过静脉内给药，例如用预填充袋、预填充笔或预填充注射器给药。在某些实施方式中，蛋白质从250ml盐水袋静脉内给予，并且静脉内输注可以持续约1小时(例如，50至80分钟)。在某些实施方式中，袋连接包括管和/或针的通道。

在一些实施方式中，III期NSCLC显示鳞状或非鳞状组织学。例如在一个实施方式中，所述方法治疗III期鳞状NSCLC。在一些实施方式中，所述方法治疗非鳞状III期NSCLC。

在某些实施方式中，通过静脉内给予至少500mg(例如，约500mg，约600mg，约700mg，约800mg，约900mg，约1000mg，约1100mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg或更多)的抗PD-L1/TGFβ阱治疗具有III期NSCLC(如鳞状或非鳞状III期NSCLC)的未经治疗的对象或患者，其中该抗PD-L1/TGFβ阱包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，通过静脉内给予至少500mg(例如，约500mg，约600mg，约700mg，约800mg，约900mg，约1000mg，约1100mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg或更多)的抗PD-L1/TGFβ阱治疗具有III期NSCLC(如鳞状或非鳞状III期NSCLC)的未经治疗的对象或患者，其中该抗PD-L1/TGFβ阱包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列。在某些实施方式中，通过静脉内给予2400mg的抗PD-L1/TGFβ阱治疗具有III期NSCLC(如鳞状或非鳞状III期NSCLC)的未经治疗的对象或患者，其中该抗PD-L1/TGFβ阱包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列。

在某些实施方式中，具有III期NSCLC(如鳞状或非鳞状NSCLC)的未经治疗的对象或患者通过静脉内给予约1200mg-约2400mg(例如，约1200mg-约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约2400mg，约1400mg至约2400mg，约1500mg至约2400mg，约1600mg至约2400mg，约1700mg至约2400mg，约1800mg至约2400mg，约1900mg至约2400mg，约2000mg至约2400mg，约2100mg至约2400mg，约2200mg至约2400mg，或约2300mg至约2400mg)的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗，其中该抗PD-L1/TGFβ阱包括第一多肽，该多肽具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列，以及第二多肽，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在某些实施方式中，具有III期NSCLC(如鳞状或非鳞状NSCLC)的未经治疗的对象或患者通过静脉内给予约1200mg-约2400mg(例如，约1200mg-约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约2400mg，约1400mg至约2400mg，约1500mg至约2400mg，约1600mg至约2400mg，约1700mg至约2400mg，约1800mg至约2400mg，约1900mg至约2400mg，约2000mg至约2400mg，约2100mg至约2400mg，约2200mg至约2400mg，或约2300mg至约2400mg)的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗，其中该抗PD-L1/TGFβ阱包括第一多肽，该多肽具有SEQ ID NO：35、36和37的氨基酸序列，以及第二多肽，其包含SEQ IDNO：38、39和40的氨基酸序列。

在某些实施方式中，具有III期NSCLC(如鳞状或非鳞状NSCLC)的未经治疗的对象或患者通过每两周一次静脉内给予约1200mg剂量的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。在某些实施方式中，具有III期NSCLC(如鳞状或非鳞状NSCLC)的未经治疗的对象或患者通过每三周一次静脉内给予约1800mg剂量的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。在某些实施方式中，具有III期NSCLC(如鳞状或非鳞状NSCLC)的未经治疗的对象或患者通过每三周一次静脉内给予约2400mg剂量的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。在某些实施方式中，具有III期NSCLC(如鳞状或非鳞状NSCLC)的未经治疗的对象或患者通过每三周一次静脉内给予2400mg剂量的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。

在一些实施方式中，待治疗的III期NSCLC为PD-L1阳性。在一些实施方式中，待治疗的III期NSCLC为PD-L1阴性。在示例性实施方式中，待治疗的III期NSCLC表现出高PD-L1表达(例如，“高PD-L1”)。在示例性实施方式中，待治疗的III期NSCLC不表现出PD-L1表达。在示例性实施方式中，待治疗的III期NSCLC患者被诊断为PD-L1阳性III期NSCLC。在示例性实施方式中，待治疗的III期NSCLC患者被诊断为PD-L1阴性III期NSCLC。

检测例如癌症或肿瘤上的生物标志物例如PD-L1的方法是本领域常规的并且纳入本文。非限制性实例包括免疫组织化学，免疫荧光和荧光活化细胞分选(FACS)。在某些实施方式中，使用抗PD-L1抗体检测III期NSCLC中的PD-L1表达水平。组织样品可以是福尔马林固定的，石蜡包埋的III期NSCLC组织。

在一些实施方式中，具有高PD-L1，III期NSCLC或不考虑PD-L1表达(III期NSCLC为PD-L1阳性或PD-L1阴性)(例如鳞状或非鳞状III期NSCLC)的未经治疗的对象或患者通过以至少500mg的剂量静脉内给予抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。在一些实施方式中，具有高PD-L1，III期NSCLC或不考虑PD-L1表达(III期NSCLC为PD-L1阳性或PD-L1阴性)(例如鳞状或非鳞状III期NSCLC)的未经治疗的对象或患者通过以每两周一次约1200mg的剂量静脉内给予抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。在一些实施方式中，具有高PD-L1，III期NSCLC或不考虑PD-L1表达(III期NSCLC为PD-L1阳性或PD-L1阴性)(例如鳞状或非鳞状III期NSCLC)的未经治疗的对象或患者通过以每三周一次约1800mg的剂量静脉内给予抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。在一些实施方式中，具有高PD-L1，III期NSCLC或不考虑PD-L1表达(III期NSCLC为PD-L1阳性或PD-L1阴性)(例如鳞状或非鳞状III期NSCLC)的未经治疗的对象或患者通过以每三周一次约2400mg的剂量静脉内给予抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。

在某些实施方式中，用顺铂/培美曲塞和放疗(cCRT)与抗PD-L1/TGFβ阱联合治疗的患者被诊断患有晚期不可切除的III期NSCLC，其表达PD-L1。在某些实施方式中，用顺铂/培美曲塞和放疗(cCRT)与抗PD-L1/TGFβ阱联合治疗的患者被诊断患有晚期不可切除的III期NSCLC，其不表达PD-L1。在某些实施方式中，将诊断为晚期不可切除的III期NSCLC的患者用化疗(例如，顺铂/培美曲塞)和放疗(cCRT)与抗PD-L1/TGFβ阱联合治疗，而与PD-L1表达无关(III期NSCLC是PD-L1阳性或PD-L1阴性)。

在一些实施方式中，将诊断为晚期III期NSCLC(例如鳞状或非鳞状III期NSCLC)的患者用化疗(例如顺铂和依托泊苷的组合，或卡铂和紫杉醇的组合)和放疗(cCRT)与PD-L1/TGFβ阱联合治疗，与PD-L1表达无关(III期NSCLC均为PD-L1阳性或PD-L1阴性)，通过静脉内给予至少500mg的抗PD-L1/TGFβ阱。在一些实施方式中，将诊断为晚期III期NSCLC(例如鳞状或非鳞状III期NSCLC)的患者用化疗(例如顺铂和依托泊苷的组合，或卡铂和紫杉醇的组合)和放疗(cCRT)与PD-L1/TGFβ阱联合治疗，与PD-L1表达无关(III期NSCLC均为PD-L1阳性或PD-L1阴性)，通过每两周一次静脉内给予约1200mg剂量的抗PD-L1/TGFβ阱。在一些实施方式中，将诊断为晚期III期NSCLC(例如鳞状或非鳞状III期NSCLC)的患者用化疗(例如顺铂和依托泊苷的组合，或卡铂和紫杉醇的组合)和放疗(cCRT)与PD-L1/TGFβ阱联合治疗，与PD-L1表达无关(III期NSCLC均为PD-L1阳性或PD-L1阴性)，通过每三周一次静脉内给予约1800mg或2400mg剂量的抗PD-L1/TGFβ阱。

在一些实施方式中，将诊断为晚期不可切除的III期NSCLC的具有非鳞状组织学的患者用化疗(例如顺铂和培美曲塞的组合)和放疗(cCRT)与抗PD-L1/TGFβ阱联合治疗，与PD-L1表达无关(III期NSCLC为PD-L1阳性或PD-L1阴性)，通过静脉内给予至少500mg的抗PD-L1/TGFβ阱。在一些实施方式中，将诊断为晚期不可切除的III期NSCLC的具有非鳞状组织学的患者用化疗(例如顺铂和培美曲塞的组合)和放疗(cCRT)与抗PD-L1/TGFβ阱联合治疗，与PD-L1表达无关(III期NSCLC为PD-L1阳性或PD-L1阴性)，通过每两周一次静脉内给予约1200mg的抗PD-L1/TGFβ阱。在一些实施方式中，将诊断为晚期不可切除的III期NSCLC的具有非鳞状组织学的患者用化疗(例如顺铂和培美曲塞的组合)和放疗(cCRT)与抗PD-L1/TGFβ阱联合治疗，与PD-L1表达无关(III期NSCLC为PD-L1阳性或PD-L1阴性)，通过每三周一次静脉内给予约1800mg或2400mg的抗PD-L1/TGFβ阱。

在某些实施方式中，本公开提供了通过给予患者与基于铂的化学放射(cCRT)并行和之后的至少500mg(例如，约500mg，约500mg，600mg，约700mg，约800mg，约900mg，约1000mg，约1100mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg或以上)的抗-PD-L1/TGFβ的组合来治疗患者的晚期不可切除的III期NSCLC的方法。在某些实施方式中，本公开提供了通过给予患者与基于铂的化学放射(cCRT)并行和之后的约1200mg的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗患者的晚期不可切除的III期NSCLC的方法。在某些实施方式中，本公开提供了通过给予患者与基于铂的化学放射(cCRT)并行和之后的约1800mg的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗患者的晚期不可切除的III期NSCLC的方法。在某些实施方式中，本公开提供了通过给予患者与基于铂的化学放射(cCRT)并行和之后的约2400mg的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗患者的晚期不可切除的III期NSCLC的方法。

在一些实施方式中，待治疗的未经治疗的对象或患者具有选自EGFR致敏突变、ALK易位和ROS1突变的突变。例如，在一些实施方式中，具有高PD-L1的III期NSCLC，或与PD-L1表达无关(III期NSCLC为PD-L1阳性或PD-L1阴性)(例如鳞状或非鳞状III期NSCLC)的具有选自EGFR致敏突变，ALK易位和ROS1突变的未经治疗的对象或患者通过静脉内给予至少500mg(例如约500mg，约600mg，约700mg，约800mg，约900mg，约1000mg，约1100mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg或更多)的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。在一些实施方式中，具有高PD-L1，III期NSCLC，或与PD-L1表达无关(III期NSCLC为PD-L1阳性或PD-L1阴性)(例如鳞状或非鳞状III期NSCLC)的具有选自EGFR致敏突变，ALK易位和ROS1突变的未经治疗的对象或患者通过每两周一次静脉内给予约1200mg的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。在一些实施方式中，具有高PD-L1，III期NSCLC，或与PD-L1表达无关(III期NSCLC为PD-L1阳性或PD-L1阴性)(例如鳞状或非鳞状NSCLC)的具有选自EGFR致敏突变，ALK易位和ROS1突变的未经治疗的对象或患者通过每三周一次静脉内给予约1800mg的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。在一些实施方式中，具有高PD-L1，III期NSCLC，或与PD-L1表达无关(III期NSCLC为PD-L1阳性或PD-L1阴性)(例如鳞状或非鳞状NSCLC)的具有选自EGFR致敏突变，ALK易位和ROS1突变的未经治疗的对象或患者通过每三周一次静脉内给予约2400mg的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。

在一些实施方式中，未经治疗的对象或患者不具有选自EGFR致敏突变、ALK易位、ROS1突变和BRAF V600E突变的突变。例如，在一些实施方式中，具有高PD-L1的III期NSCLC，或与PD-L1表达无关(III期NSCLC为PD-L1阳性或PD-L1阴性)(例如鳞状或非鳞状III期NSCLC)的不具有选自EGFR致敏突变，ALK易位，ROS1突变和BRAF V600E突变的未经治疗的对象或患者通过静脉内给予至少500mg(例如约500mg，约600mg，约700mg，约800mg，约900mg，约1000mg，约1100mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg或更多)的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。在一些实施方式中，具有高PD-L1，III期NSCLC，或与PD-L1表达无关(III期NSCLC为PD-L1阳性或PD-L1阴性)(例如鳞状或非鳞状III期NSCLC)的不具有选自EGFR致敏突变，ALK易位，ROS1突变和BRAF V600E突变的未经治疗的对象或患者通过每两周一次静脉内给予约1200mg的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。在一些实施方式中，具有高PD-L1，III期NSCLC，或与PD-L1表达无关(III期NSCLC为PD-L1阳性或PD-L1阴性)(例如鳞状或非鳞状NSCLC)的不具有选自EGFR致敏突变，ALK易位，ROS1突变和BRAF V600E突变的未经治疗的对象或患者通过每三周一次静脉内给予约1800mg的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。在一些实施方式中，具有高PD-L1，III期NSCLC，或与PD-L1表达无关(III期NSCLC为PD-L1阳性或PD-L1阴性)(例如鳞状或非鳞状NSCLC)的不具有选自EGFR致敏突变，ALK易位，ROS1突变和BRAF V600E突变的未经治疗的对象或患者通过每三周一次静脉内给予约2400mg的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。

在一些实施方式中，本文公开的治疗方法导致对象或患者的疾病缓解或改善的生存期(例如，生存期长至并包括6个月，12个月，18个月，22个月，28个月，32个月，38个月，44个月，50个月，56个月，62个月，68个月，74个月，80个月，86个月，92个月，98个月，104个月或110个月)。在某些实施方式中，改善的生存期是至少108个月。例如，在一些实施方式中，疾病缓解可以是完全缓解，部分缓解或病情稳定。在一些实施方式中，例如，改善的生存期(例如，生存期长至并包括6个月，12个月，18个月，22个月，28个月，32个月，38个月，44个月，50个月，56个月，62个月，68个月，74个月，80个月，86个月，92个月，98个月，104个月或110个月)可以是无进展生存期(PFS)或总体生存期(OS)。在某些实施方式中，改善的PFS和/或OS生存期是至少108个月。在一些实施方案中，相对于开始用本发明的抗PD-L1/TGFβ阱治疗之前的时期来确定改善(例如，在PFS中)。确定癌症或肿瘤疗法的疾病缓解(例如，完全缓解，部分缓解或病情稳定)和患者生存期(例如，PFS，总体生存期(例如，长至且包括6个月，12个月，18个月，22个月，28个月，32个月，38个月，44个月，50个月，56个月，62个月，68个月，74个月，80个月，86个月，92个月，98个月，104个月或110个月))是本领域常规的并且在本文中考虑到。在某些实施方式中，患者生存期是至少108个月。在一些实施方式中，接受治疗的患者在患病区域(例如，覆盖胸膜入口至耻骨联合的上方范围的胸部/腹部和骨盆)接受相差增强计算机断层摄影(CT)或磁共振显影(MRI)之后，根据RECIST 1.1评估疾病缓解。

递送装置

在一个方面，本公开提供用于未经治疗癌症患者中III期NSCLC治疗或肿瘤生长抑制的方法的药物递送装置，其中该装置包括制剂，该制剂包含约500mg-30000mg的蛋白质，该蛋白质包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含：(a)能够结合人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体的至少重链可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段，所述第二多肽包含：能够结合PD-L1的抗体的至少轻链可变区，并且第一多肽的重链和第二多肽的轻链在组合时形成能结合PD-L1的抗原结合位点。

在某些实施方式中，该装置可以是袋，笔或注射器。在某些实施方式中，袋可以连接包括管和/或针的通道。

在某些实施方式中，用于未经治疗癌症患者中III期NSCLC治疗或肿瘤生长抑制，同时使与相伴放疗相关的病理状况(例如肺纤维化，肺炎)的发展最小化，并增加患者III期NSCLC的转移开始时间和/或向远处转移的时间的方法的药物递送装置可包含约500mg至约3000mg(例如，约500mg至约3000mg，约500mg至约2900mg，约500mg至约2800mg，约500mg至约2700mg，约500mg至约2600mg，约500mg至约2500mg，约500mg至约2400mg，约500mg至约2300mg，约500mg至约2200mg，约500mg至约2100mg，约500mg至约2000mg，约500mg至约1900mg，约500mg至约1800mg，约500mg至约1700mg，约500mg至约1600mg，约500mg至约1500mg，约500mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约3000mg，约1400mg至约3000mg，约1500mg至约3000mg，约1600mg至约3000mg，约1700mg至约3000mg，约1800mg至约3000mg，约1900mg至约3000mg，约2000mg至约3000mg，约2100mg至约3000mg，约2200mg至约3000mg，约2300mg至约3000mg，约2400mg至约3000mg，约2500mg至约3000mg，约2600mg至约3000mg，约2700mg至约3000mg，约2800mg至约3000mg mg，约2900mg至约3000mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约500mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg，约2500mg，约2600mg，约2700mg，约2800mg，约3,000mg或约3000mg)的本公开的蛋白质(例如抗PD-L1/TGFβ阱，其具有包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽；或包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物)。在某些实施方式中，药物递送装置可包含约500-1200mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱，其包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQID NO：1的氨基酸序列的第二多肽)。在某些实施方式中，药物递送装置可包含约500mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱，其包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽；或包含SEQ ID NO：35、36和37的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物)。

在某些实施方式中，药物递送装置可包含约1200mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱，其包括包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽；或包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物)。在某些实施方式中，用于未经治疗癌症患者中III期NSCLC治疗或肿瘤生长抑制，同时使与相伴放疗相关的病理状况(例如肺纤维化，肺炎)的发展最小化，并增加患者III期NSCLC的转移开始时间和/或向远处转移的时间的方法的药物递送装置包括约1800mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱，其包括包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽；或具有包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ IDNO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物)。在某些实施方式中，用于未经治疗癌症患者中III期NSCLC治疗或肿瘤生长抑制，同时使与相伴放疗相关的病理状况(例如肺纤维化，肺炎)的发展最小化，并增加患者III期NSCLC的转移开始时间和/或向远处转移的时间的方法的药物递送装置包括约1200mg、约1800mg或2400mg剂量的蛋白质，其具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽；或蛋白质产物，其具有包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽。

在某些实施方式中，用于未经治疗癌症患者中III期NSCLC治疗或肿瘤生长抑制，同时使与相伴放疗相关的病理状况(例如肺纤维化，肺炎)的发展最小化，并增加患者III期NSCLC的转移开始时间和/或向远处转移的时间的方法的药物递送装置包括约1,200mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽；或具有包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物))。在某些实施方式中，用于未经治疗癌症患者中III期NSCLC治疗或肿瘤生长抑制的方法的药物递送装置包括约1800mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱，(例如包括包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽；或具有包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物))。在某些实施方式中，用于未经治疗癌症患者中III期NSCLC治疗或肿瘤生长抑制的方法的药物递送装置可包含约500mg，约525mg，约550mg，约575mg，约600mg，约625mg，约650mg，约675mg，约700mg，约725mg，约750mg，约775mg，约800mg，约825mg，约850mg，约875mg，约900mg，约925mg，约950mg，约975mg，约1000mg，约1025mg，约1050mg，约1075mg，约1100mg，约1125mg，约1150mg，约1175mg，约1200mg，约1225mg，约1250mg，约1275mg，约1300mg，约1325mg，约1350mg，约1375mg，约1400mg，约1425mg，约1450mg，约1475mg，约1500mg，约1525mg，约1550mg，约1575mg，约1600mg，约1625mg，约1650mg，约1675mg，约1700mg，约1725mg，约1750mg，约1775mg，约1800mg，约1825mg，约1850mg，约1875mg，约1900mg，约1925mg，约1950mg，约1975mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg或约2400mg的本公开的蛋白质(例如，抗-PD-L1/TGFβ阱，例如包含具有SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列的第一多肽和具有SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物)。

蛋白质生产

抗体-细胞因子阱蛋白质一般采用包含经工程改造以表达所述蛋白质的核酸的哺乳动物细胞通过重组技术来生产。尽管在US20150225483A1的实施例1和2中描述了合适的细胞系和蛋白质生产方法的一个例子，但是已有大量合适的载体、细胞系和蛋白质生产方法用来生产基于抗体的生物药物并可以用于合成本文的抗体-细胞因子阱蛋白。

治疗适应症

本申请中描述的抗PD-L1/TGFβ阱蛋白(例如，包括包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第二多肽)以及包括所述抗-PD-L1/TGFβ阱蛋白的本公开的静脉药物递送制剂和递送装置可用于治疗未经治疗的患者中的III期NSCLC或降低所述患者中的肿瘤生长。

待用抗PD-L1/TGFβ阱治疗的III期NSCLC或肿瘤可具有肿瘤中升高的PD-L1和/或TGFβ的表达、其表达水平与预后或疾病进展的相关性，以及针对肿瘤对于靶向PD-L1和TGFβ的治疗的敏感性进行的临床前和临床经验来选择。

在一些实施方式中，根据本公开的方法待治疗的未经治疗的癌症患者具有或不具有选自以下的突变：表皮生长因子受体(EGFR)致敏(激活)突变，间变性淋巴瘤激酶(ALK)易位和ROS1突变。在一些实施方式中，待根据本发明方法接受治疗的具有高PD-L1表达的未经治疗的癌症(例如，晚期III期NSCLC(例如，鳞状或非鳞状III期NSCLC)；PD-L1阳性晚期III期NSCLC(例如，鳞状或非鳞状III期NSCLC)；或PD-L1阴性晚期III期NSCLC(例如，鳞状或非鳞状III期NSCLC))的患者具有或不具有表皮生长因子受体(EGFR)致敏(激活)突变。在一些实施方式中，待根据本发明方法接受治疗的具有高PD-L1表达的未经治疗的癌症(例如，晚期III期NSCLC(例如，鳞状或非鳞状III期NSCLC)；PD-L1阳性晚期III期NSCLC(例如，鳞状或非鳞状III期NSCLC)；或PD-L1阴性晚期III期NSCLC(例如，鳞状或非鳞状III期NSCLC))的患者具有或不具有间变性淋巴瘤激酶(ALK)易位。在一些实施方式中，待根据本发明方法接受治疗的具有高PD-L1表达的未经治疗的癌症(例如，晚期III期NSCLC(例如，鳞状或非鳞状III期NSCLC)；PD-L1阳性晚期III期NSCLC(例如，鳞状或非鳞状III期NSCLC)；或PD-L1阴性晚期III期NSCLC(例如，鳞状或非鳞状III期NSCLC))的患者具有或不具有ROS1突变。

实施例

以上是对本公开的一般性说明，参考以下实施例将更容易理解，所述实施例仅用于说明本公开的某些方面和实施方式，无意于以任何方式限制本公开的范围。

实施例1：静脉内药物制剂包装

抗-PD-L1/TGFβ阱制剂按冻干制剂或液体制剂制备。为了制备冻干制剂，冷冻-干燥的抗-PD-L1/TGFβ阱分子被灭菌并储藏于一次性玻璃药瓶中。然后将几个这样的玻璃药瓶包装在试剂盒中，用于向经诊断患有癌症或肿瘤的对象递送特定非体重依赖性剂量。根据剂量要求，该试剂盒包含12-60个小瓶。或者，制备制剂并包装为液体制剂，并按250mg/瓶至1000mg/瓶储存。例如，制剂是液体制剂并按600mg/瓶储存，或按250mg/瓶储存。在另一个实例中，将抗-PD-L1/TGFβ阱分子制备成10mg/mL的溶液，装于USP/Ph Eur type I小瓶中提供，小瓶中的装量允许有60mL(600mg/60mL)的可提取体积，遵守USP和Ph Eur要求用橡胶塞以血清格式封口并用铝卷边包封来密封。

一个诊断为III期NSCLC的对象静脉内给予含500mg至2400mg抗-PD-L1/TGFβ阱的制剂。例如，对该对象静脉内给予1200mg抗-PD-L1/TGFβ阱，每两周给药一次，或给予1800mg抗-PD-L1/TGFβ阱，每三周给药一次。通过盐水袋进行静脉内给药。抗-PD-L1/TGFβ阱分子给药量是不依赖于对象体重的。

实施例2：抗-PD-L1/TGFβ阱在缓解cCRT-诱导的纤维化中的作用

在该实施例中，描述了评估与放射或化疗联合给予的抗PD-L1/TGFβ阱对缓解肺纤维化的作用的实验。

细胞系：从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的4T1鼠乳腺癌细胞在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基(生命技术公司(Life Technologies))中培养。所有细胞在无菌条件下培养，并于37

小鼠：BALB/c获自查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)。所有实验用小鼠均为6至12周龄的雌鼠。小鼠笼养于无病原体的设施中，自由进食和饮水。

鼠肿瘤模型：在治疗开始前6天，将0.5×10

治疗：对于所有研究，在治疗开始当天(第0天)将小鼠随机分成各治疗组。

抗PD-L1/TGFβ阱和对照：本公开的抗PD-L1/TGFβ阱是与人TGF-β受体II的胞外域融合的针对人PD-L1的完整人免疫球蛋白1(IgG1)单克隆抗体(例如，包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽)。同型对照是抗PD-L1的突变形式，完全没有PD-L1结合性。在荷瘤小鼠中，在第0、2和4天，抗PD-L1/TGFβ阱(492μg)或同型对照(400μg)配制于0.2mL PBS中静脉注射(i.v.)给药。非荷瘤BALB/c小鼠静脉注射抗PD-L1/TGFβ阱(20mg/kg)，抗PD-L1(16.3mg/kg)，阱对照(抗PD-L1(mut)/TGF-β阱，20mg/kg)或同种型对照(抗PD-L1(mut)，16.3mg/kg)。

CCl

放射：为了评估放射与抗PD-L1/TGFβ阱的组合，将小鼠随机分成以下治疗组：同种型对照(133，400μg)+载剂对照(0.2mL)，放射(3.6，7.5，8Gy/天)，抗PD-L1/TGFβ阱(164，492μg)或抗PD-L1/TGFβ阱+放射。为了进行放疗，用带铅屏蔽的准直仪将递送定位到小鼠的荷瘤腿。通过定时暴露于铯137γ辐照仪(

CCl

组织学：将左肝样品送至Histotox(科罗拉多州博尔得(Boulder，CO))进行处理和染色。通过标准组织学方法，来自内侧叶的上部，中部和下部的5μm切片对αSMA(Abcam，目录号ab124964，1:200)和苦味红染色。为了优化玻片的形态分析，省去了二次染色或背景染色，因此只显示了阳性染色的细胞或结构。使用Agilent Envision+Rabbit HRP试剂盒(目录号K4011)标记一抗，该试剂盒包括可进行DAB显色的HRP标记的二抗。

SMAD/phosphoSMAD分析：将在RIPA缓冲液(Sigma)中含有0.02％的HALT蛋白酶抑制剂混合物(Thermo)和1mM EDTA的组织裂解液以1:2的重量:体积的比例添加到冰冻的肝样品中，同时进行解冻。然后在Tissuelyser(Qiagen)中使用磁珠破碎机以30/秒的频率将样本均质化2分钟。破坏后，将裂解液在4℃下于12000rpm离心20分钟。将上清液等分并通过20μM筛孔滤板(EMD Millipore)过滤。将最终的裂解液冷冻在-80℃中以备后续分析，或根据制造商的说明使用SMAD2/3和phosphoSMAD 2/3ELISA(Cell Signaling)直接测量。

形态分析：使用Hamamatsu Nanozoomer扫描仪和Digital Pathology软件对载玻片进行数字扫描。使用Hamamatsu NDP.view软件查看保存的图像并将其缩小至1.5％缩放。使用Image Pro Premier通过对阳性染色细胞进行阈值分析来分析最终图像。将相同的阈值应用于所有组织。图像代表平均结果。

RNA-seq分析：将RNA映射到Ensembl 75小鼠基因组(GRCm38，2014年2月)，用Bowtie 2对齐(Langmead和Salzber(2012),Nat.Methods,9(4):357-359)，并用RSEM进行定量(Li,B.和Dewey(2011),BMC Bioinformatics,12:323)。

特征评分定义为各基因标签中所有基因的平均log

α-SMA免疫组织化学：将分离的肿瘤在室温下于10％中性福尔马林(NBF)中固定24小时，脱水并包埋在石蜡中。将组织切成5μm的切片，然后转移到带正电的载玻片上。染色前，将切片脱蜡并重新水化。使用已建立的方案和Leica BOND-RX自动染色剂进行抗α-SMA免疫组织化学。简而言之，使用表位修复溶液2(Leica，目录号AR9640)在95℃下进行抗原修复20分钟。封闭后，将切片用HRP偶联的5μg/ml抗α-SMA抗体(克隆1A4，Sigma，目录号SAB420067)孵育60分钟。使用二氨基联苯胺底物(DAB)进行检测，并将切片用苏木精复染。染色完成后，将载玻片脱水并盖玻片。使用Hamamatsu Nanozoomer显微镜对染色的切片进行成像。

使用Aperio ImageScope软件(版本12.3.2.8013)对图像进行数字量化。对于每个肿瘤，分析了多个感兴趣区域(ROI)(8-11ROI)。分析中排除了坏死区域和肿瘤边缘。确定DAB高于背景的总阳性像素，并将其除以ROI中的像素总数，以获得每个ROI的阳性百分比。使用GraphPad Prism绘制通过平均化ROI值获得的每个肿瘤的阳性百分比评分。

统计学分析：用GraphPad Prism软件7.0版进行统计分析。对于pSMAD和苦味红分析，未配对的两尾t检验用于比较治疗与同型对照。为了评估治疗组之间基因特征评分的差异，进行单向方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey多重比较检验。

抗-PD-L1/TGFβ阱和阱对照，但不是抗-PD-L1，减少了化疗诱导的纤维化CCl

在该实验中，使用了五组小鼠：未经处理的BALB/c小鼠(Nv)(n＝4小鼠/组)，使用CCl

6周后收获小鼠，并对肝脏进行苦味红或pSMAD2/3染色。CCl

采用-PD-L1/TGFβ阱和放疗的组合疗法降低EMT和促纤维化基因特征评分

为了检查诱导联合疗法抗肿瘤活性增强的潜在作用机制，对通过靶向的RNA测序(RNAseq)在4T1肿瘤组织中的基因表达进行概况分析。

图13A，13B和图8显示了来自4T1模型中RNAseq分析的数据。将BALB/c小鼠肌肉内(i.m.)接种0.5×10

作为RNA测序分析的一部分，将基因分为功能组，并确定“特征(signature)评分”作为基因表达的度量。相对于同种型对照，抗PD-L1/TGFβ阱单一疗法导致上皮-间质转化(EMT)特征评分降低(p<0.0001)。尽管增加放疗不会显著影响EMT特征(p>0.05)，但抗PD-L1/TGFβ阱和放疗的组合相对于同型对照显著下调了EMT特征评分(p<0.0001)(图13A)。

抗PD-L1/TGFβ阱单一疗法也降低了促纤维化基因特征评分，但相对于同型对照，放疗显著提高了促纤维化基因特征评分(p＜0.0001)。此外，将放射与抗PD-L1/TGFβ阱相结合相对于单独放射降低了促纤维化信号特征评分(图13B)。抗PD-L1/TGFβ阱治疗后，放射诱导的纤维化基因特征评分(基于Alsner等，(2007)Radiotherapy and Oncology,83(3):261-266)相似地降低(p＝0.0014)。值得注意的是，相对于放射单一疗法，抗PD-L1/TGFβ阱疗法与放疗结合后能够显著降低放射诱导的纤维化特征(p＝0.0365)(图8)。对于放射诱导的纤维化基因特征评分，测量了Cdc6，Cxcl12和Fap的表达水平。在单基因水平上，Fap下调了27.1％，通过limma调整了p值0.0107(该调整是所测得的总体基因)。Cdc6和Cxcl12的变化不显著(图9)。在此比较中，Ctgf(纤维化的主要驱动因素)也下调了34.4％，p＝0.00350。

为了进一步评估抗PD-L1/TGFβ阱和放射治疗对EMT和纤维化的影响，对与成纤维细胞和EMT相关的单个基因的表达进行定量。

平滑肌α肌动蛋白(ACTA2)的表达限于平滑肌细胞，周细胞和成肌纤维细胞，并且在成肌纤维细胞功能中很重要。将BALB/c小鼠肌肉内(i.m.)接种0.5×10

在体外，通过TGF-β1处理，ACTA2表达增加。虽然单独放疗对ACTA2的表达无显著影响，但抗PD-L1/TGFβ阱单一疗法和抗PD-L1/TGFβ阱联合放疗显著降低了4T1模型中的ACTA2表达(分别为p<0.0001和p＝0.0236)(图14A)。

结缔组织生长因子(CTGF)是一种分泌的蛋白质，显示其为组织重塑和纤维化的核心介质。甚至还显示出CTGF抑制作用以逆转纤维化过程，而靶向CTGF的单克隆抗体显著减少小鼠模型中放射诱导的肺纤维化。相对于同种型对照，抗PD-L1/TGFβ阱显著降低了CTGF表达(p＝0.0019)，并且如所期望的，尽管放射治疗增加了CTGF，与放射单一疗法相比，抗PD-L1/TGFβ阱组合显著抵消放疗的影响(P＝0.0024)(图14B)。

成纤维细胞活化蛋白(FAP)在90％以上的人类上皮癌中由癌相关的成纤维细胞(CAF)高度表达，其中可通过STAT3信号传导促进TME中CAF的免疫抑制。相对于同种型对照，抗PD-L1/TGFβ阱显著降低了FAP表达(p<0.0001)，并且通过抗PD-L1/TGFβ阱与放射的组合进一步降低了用放疗观察到的FAP降低(P＝0.0054)(图14C)。

抗-PD-L1/TGFβ阱处理降低小鼠肿瘤中α-SMA表达

TGF-β活性增加会诱导CAF的标志物α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达，这可能导致耐药性并成为免疫治疗的靶标(Calon等，(2014),Semin.Cancer Biol.25:15-22；Kakarla等，(2012),Immunotherapy,4(11):1129-1138)。为了评估抗PD-L1/TGFβ阱和放疗对α-SMA表达的影响，在4T1肿瘤切片中进行了α-SMA IHC。将BALB/c小鼠肌肉内(i.m.)接种0.5×10

显示了抗α-SMA IHC的代表性图像(图16A-16D)。相对于同型对照(图16A)，抗PD-L1/TGFβ阱治疗显著降低了α-SMA表达(p<0.0001)(图16B)，而放疗显著提高了α-SMA表达(p＝0.0002)(图16C)。相对于单一放疗，抗PD-L1/TGFβ阱与放疗的组合可显著降低α-SMA表达(p＝0.0001)(图16D)，表明抗PD-L1/TGFβ阱可降低放射诱导的CAF活性。

实施例3：对未经治疗的III期NSCLC患者组的抗-PD-L1/TGFβ阱给药与相伴的化疗和放疗(cCRT)－研究设计1

未经治疗的III期非小细胞肺癌(NSCLC)患者用抗PD-L1/TGFβ阱与cCRT联合治疗，然后使用抗PD-L1/TGFβ阱进行巩固治疗(组1)，并与参加cCRT，然后接受抗PD-L1/TGFβ阱的巩固治疗的患者(组2)，和接受cCRT治疗随后接受度伐鲁单抗(durvalumab)治疗的患者(组3)进行比较。在一个示例性实施方式中，cCRT以顺铂/依托泊苷，顺铂/培美曲塞或卡铂/紫杉醇的形式与通过强度调节的放疗递送的60-66Gy(例如60Gy)总放射剂量并行给药。化疗方案是分级因素。

在一个示例性实施方式中，每两周一次以1200mg的BW非依赖性剂量向患有III期非小细胞肺癌(NSCLC)的癌症患者给予抗PD-L1/TGFβ阱。静脉内给药持续约1小时(-10分钟/+20分钟，例如，50分钟至80分钟)。在一个示例性实施方式中，每三周一次以1800mg的BW非依赖性剂量向患有III期非小细胞肺癌(NSCLC)的癌症患者给予抗PD-L1/TGFβ阱。静脉内给药持续约1小时(-10分钟/+20分钟，例如，50分钟至80分钟)。在一个示例性实施方式中，每三周一次以2400mg的BW非依赖性剂量向患有III期非小细胞肺癌(NSCLC)的癌症患者给予抗PD-L1/TGFβ阱。静脉内给药持续约1小时(-10分钟/+20分钟，例如，50分钟至80分钟)。在一个或多个示例性实施方式中，为了减轻潜在的输液相关反应，对于前2次输注，每剂量抗-PD-L1/TGFβ阱分子用药前约30至60分钟给予抗组胺药和扑热息痛(对乙酰氨基酚)(例如，25-50mg苯海拉明和500-650mg扑热息痛[对乙酰氨基酚]静脉内或口服等效物)的预先用药。如果在前两次输注期间看到≥2级输液反应，不停止预先用药。禁止使用类固醇作为预先用药。

下面是该实施例中患者的纳入标准。患者：

-≥18岁(知情同意下入组)

-在组织学或细胞学上已诊断出局部晚期不可切除的(III期)NSCLC

-距在先开胸手术至少3周(如果已进行)

-自诊断III期NSCLC以来，尚未接受过先前的全身疗法治疗，也未接受任何靶向T细胞共调节蛋白(免疫检查点)的抗体或药物，例如抗PDL1或抗CTLA-4抗体

-预期寿命至少为12周(根据医生对诊断后患者预后的评估)

-有可用的肿瘤物质(<6个月大)足以进行生物标志物分析

-东部合作肿瘤协作组表现状态(ECOG PS)为0到1

-具有足够的肺功能，定义为随机分组前三周内测得的1秒内的呼气量(FEV

-有足够的血液学功能，定义为绝对中性粒细胞计数(ANC)≥1.5×10

-具有足够的肝功能，其定义为总胆红素水平≤1.5×正常上限(ULN)，天冬氨酸转氨酶(AST)水平≤3.0×ULN，丙氨酸转氨酶(ALT)水平≤3.0×ULN和碱性磷酸酶≤2.5ULN。

-对于Cr>1.5x ULN的参与者，具有足够的肾功能，由肌酸≤1.5×ULN或计算的肌酐清除率(CrCl)≥50mL/分钟定义(也可以使用GFR)

-有足够的凝血功能，定义为国际标准化比率(INR)或凝血酶原时间(PT)≤1.5×ULN，除非参试者正在接受抗凝血剂治疗；且活化部分凝血活酶时间(aPTT)≤1.5×ULN，除非参试者正在接受抗凝血剂治疗。

实施例4：对未经治疗的III期NSCLC患者组的抗-PD-L1/TGFβ阱给药与相伴的化疗和放疗(cCRT)－研究设计2

未经治疗的III期非小细胞肺癌(NSCLC)患者用抗PD-L1/TGFβ阱与cCRT联合治疗，然后使用抗PD-L1/TGFβ阱进行巩固治疗(组1)，并与接受每两周10mg/kg的度伐鲁单抗联合cCRT治疗，然后每两周10mg/kg的度伐鲁单抗(组2)治疗的患者，以及单独接受cCRT然后安慰剂治疗的患者(组3)进行比较。在一个示例性实施方式中，cCRT以顺铂/依托泊苷，顺铂/培美曲塞或卡铂/紫杉醇的形式与通过强度调节的放疗递送的60-66Gy(例如60Gy)总放射剂量并行给药。化疗方案是分级因素。

在一个示例性实施方式中，每两周一次向患有III期非小细胞肺癌(NSCLC)的癌症患者给予1200mg的BW非依赖性剂量。静脉内给药持续约1小时(-10分钟/+20分钟，例如，50分钟至80分钟)。在一个示例性实施方式中，每三周一次以1800mg的BW非依赖性剂量向患有III期非小细胞肺癌(NSCLC)的癌症患者给予抗PD-L1/TGFβ阱。静脉内给药持续约1小时(-10分钟/+20分钟，例如，50分钟至80分钟)。在一个示例性实施方式中，每三周一次以2400mg的BW非依赖性剂量向患有III期非小细胞肺癌(NSCLC)的癌症患者给予抗PD-L1/TGFβ阱。静脉内给药持续约1小时(-10分钟/+20分钟，例如，50分钟至80分钟)。在一个或多个示例性实施方式中，为了减轻潜在的输液相关反应，对于前2次输注，每剂量抗-PD-L1/TGFβ阱分子用药前约30至60分钟给予抗组胺药和扑热息痛(对乙酰氨基酚)(例如，25-50mg苯海拉明和500-650mg扑热息痛[对乙酰氨基酚]静脉内或口服等效物)的预先用药。如果在前两次输注期间看到≥2级输液反应，不停止预先用药。禁止使用类固醇作为预先用药。

实施例4的纳入标准与实施例2相似，但是可以根据研究者的判断进行调整。

实施例5：用抗-PD-L1/TGFβ阱治疗III期NSCLC患者的治疗功效

如实施例3和4所述，将根据RECIST 1.1的无进展生存期(PFS)作为接受抗PD-L1/TGFβ阱与cCRT结合治疗的参与者的主要终点进行测量。研究了各实施例的组间功效差异。

在一个示例性实施方式中，在基于cCRT的诱导期间，在60分钟内或根据当地标准在第1、8、29、36天以50mg/m

根据当地规定，给予由H2阻滞剂，止吐药，地塞米松(口服或静脉注射)组成的标准处方药。根据当地惯例，确保接受顺铂/依托泊苷的参与者治疗前后的足够水合。

在一个示例性实施方式中，在基于cCRT的诱导期间，在60分钟内或根据当地标准在每周第1天以45mg/m

根据调查人员的决定，对于接受卡铂/紫杉醇方案治疗且无法接受抗PD-L1/TGFβ阱或度伐鲁单抗作为巩固治疗的参与者，应再进行2个周期的卡铂/紫杉醇(卡铂AUC 6，紫杉醇200mg/m

在基于cCRT的诱导过程中，每周第1天根据当地标准或基于AUC 2在30分钟内静脉注射给予卡铂。紫杉醇给药后，卡铂将与标准止吐药同时给予。

治疗功效也可以用另外三个结果决定因素来测量。可以用客观缓解率(ORR)来衡量治疗效果，根据美国食品药品监督管理局的说法，它是“肿瘤大小减少了预定量并持续了最小时间段的患者比例”。参见FDA 2007。根据美国国家癌症研究所(NCI)，完全缓解是“对治疗有反应，所有癌症征象均消失”。ORR是治疗功效优于CR的首选度量。参见Kogan和Haren(2008)，Biotech.Healthcare,5(1):22-35。治疗功效的另一项度量是总生存期(OS)，即从随机分组到计划评估的时间，例如57个月。治疗效果也可以用疗效持续时间(从CR或部分缓解(PR)到疾病进展(PD)，死亡或最后一次肿瘤评估来评估)来衡量，其是从随机分组到计划评估的时间，例如57个月。

覆盖从胸腔入口上方到耻骨联合的区域的胸部/腹部和骨盆对比增强计算机断层扫描(CT)是评估治疗功效的首选成像方式。巩固治疗前的肿瘤评估应尽可能接近巩固治疗开始之前，并在基于CRT的诱导结束后的14天内进行。对于从与cCRT相关的毒性中恢复的患者，从cCRT结束起，巩固治疗开始时间最多延迟42天。参与者每隔6周进行X射线成像评估，以评估参与者首次服药后15个月内对治疗的反应，然后每12周进行一次。

研究其他终点以进一步确立治疗功效。例如，与基线相比，通过肿瘤体积分析评估肿瘤大小的变化，并通过PET扫描测量肿瘤代谢体积的变化。肺纤维化相对于基线的变化通过高分辨率CT扫描和肺功能测试进行测量。通过检查血浆或肿瘤组织中的突变类型和数量(肿瘤突变负担(TMB))，并研究TMB与临床结果之间的相关性，评估临床反应的潜在预测生物标志物。

考虑抗-PD-L1/TGFβ阱对未经治疗的III期NSCLC患者有初始临床活性。接受治疗的患者表现出疾病缓解(如部分缓解、完全缓解、病情稳定)和/或生存期(如无进展生存期和/或总生存期)改善。考虑用抗PD-L1/TGFβ阱与相伴cCRT联合治疗然后抗PD-L1/TGFβ阱巩固治疗，与单独cCRT或用cCRT然后安慰剂治疗的患者相比，导致未经治疗的III期NSCLC患者更好的存活。

总而言之，发现抗PD-L1/TGFβ阱与相伴的cCRT是一种创新的一流的双功能融合蛋白，旨在同时靶向两种免疫抑制途径：PD-L1和TGF-β，从而治疗III期NSCLC，同时使与相伴的放疗相关的纤维化发展最小化，并增加了患者III期NSCLC的转移开始时间和/或向远处转移的时间。

实施例6：对晚期不可切除的III期NSCLC患者组的抗-PD-L1/TGFβ阱给药与相伴的化疗和放疗(cCRT)－研究设计3

晚期不可切除的III期非小细胞肺癌(NSCLC)患者用抗PD-L1/TGFβ阱与cCRT(例如基于铂的放化疗)联合治疗，然后使用抗PD-L1/TGFβ阱进行巩固治疗(组1)，并与用cCRT和与抗PD-L1/TGFβ阱匹配的安慰剂，随后接受度伐鲁单抗治疗的患者(组2)进行比较。治疗方案的示意图在图17中描述。在一个示例性实施方式中，cCRT以顺铂/依托泊苷，顺铂/培美曲塞或卡铂/紫杉醇的形式与通过强度调节的放疗递送的60-66Gy(例如60Gy)总放射剂量并行给药。化疗方案和/或PD-L1表达是研究的分级因素。

在一个示例性实施方式中，每两周一次以1200mg的BW非依赖性剂量向患有III期非小细胞肺癌(NSCLC)的癌症患者给予抗-PD-L1/TGFβ阱。静脉内给药持续约1小时(-10分钟/+20分钟，例如，50分钟至80分钟)。在一个示例性实施方式中，每三周一次以1800mg的BW非依赖性剂量向患有III期非小细胞肺癌(NSCLC)的癌症患者给予抗PD-L1/TGFβ阱。静脉内给药持续约1小时(-10分钟/+20分钟，例如，50分钟至80分钟)。在一个示例性实施方式中，每三周一次以2400mg的BW非依赖性剂量向患有III期非小细胞肺癌(NSCLC)的癌症患者给予抗PD-L1/TGFβ阱。静脉内给药持续约1小时(-10分钟/+20分钟，例如，50分钟至80分钟)。在一个或多个示例性实施方式中，为了减轻潜在的输液相关反应，对于前2次输注，每剂量抗-PD-L1/TGFβ阱分子用药前约30至60分钟给予抗组胺药和扑热息痛(对乙酰氨基酚)(例如，25-50mg苯海拉明和500-650mg扑热息痛[对乙酰氨基酚]静脉内或口服等效物)的预先用药。如果在前两次输注期间看到≥2级输液反应，不停止预先用药。禁止使用类固醇作为预先用药。

在一个示例性实施方式中，患有晚期不可切除的III期NSCLC的患者每两周静脉内1小时内输注1200mg抗PD-L1/TGFβ阱，直到在cCRT期间出现不可接受的毒性，具有确定的疾病进展以及在cCRT后长至一年。在一个示例性实施方式中，在与cCRT相伴的诱导期中给予4剂(例如，每次1200mg)的抗PD-L1/TGFβ阱。在一个或多个示例性实施方式中，在巩固期间给予26剂(例如，每次1200mg)的抗PD-L1/TGFβ阱。

在一个示例性实施方式中，依托泊苷以50mg/m

在一个示例性实施方式中，在基于cCRT的诱导期间，在60分钟内或根据当地标准在第1、8、29、36天以50mg/m

在一个示例性实施方式中，在基于cCRT的诱导期间，在60分钟内或根据当地标准在第1、22、43天以75mg/m

在第2组中，晚期不可切除的III期NSCLC患者每2周静脉输注与抗PD-L1/TGFβ阱匹配的安慰剂，直至cCRT期间可接受的毒性，证实疾病进展。度伐鲁单抗每两周一次以10mg/kg的剂量在1小时内给药，直至在cCRT期间可接受的毒性，证实疾病进展以及cCRT后长至1年。在一个或多个示例性实施方式中，在巩固期间给予26剂(例如，每次10mg/kg)的度伐鲁单抗。

在一个示例性实施方式中，为了减轻潜在的输液相关反应，对于前2次输注，每剂量抗-PD-L1/TGFβ阱分子用药前约30至60分钟给予抗组胺药和扑热息痛(对乙酰氨基酚)(例如，25-50mg苯海拉明和500-650mg扑热息痛[对乙酰氨基酚]静脉内或口服等效物)的预先用药。如果在前两次输注期间看到≥2级输液反应，不停止预先用药。禁止使用类固醇作为预先用药。

在一个示例性实施方式中，根据当地规定，给予由H2阻滞剂，止吐药，地塞米松(口服或静脉注射)组成的标准处方药。根据当地惯例，确保接受顺铂/依托泊苷的参与者治疗前后的足够水合。

下面是该实施例中患者的纳入标准。患者：

-≥18岁(知情同意下入组)

-具有组织学确认的NSCLC，其显示为III期局部晚期，不可切除的疾病(胸腔肿瘤中肺癌分期手册研究的国际协会)

-无表皮生长因子(EGFR)敏感(激活)突变、无间变型淋巴瘤激酶(ALK)易位、无ROS1重排的荷瘤患者被纳入

-具有足够的肺功能，定义为随机分组前三周内测得的1秒内的呼气量(FEV

-有足够的血液学功能，定义为绝对中性粒细胞计数(ANC)≥1.5×10

-具有足够的肝功能，其定义为总胆红素水平≤1.5×正常上限(ULN)，天冬氨酸转氨酶(AST)水平≤3.0×ULN，丙氨酸转氨酶(ALT)水平≤3.0×ULN和碱性磷酸酶≤2.5ULN

-对于Cr>1.5×ULN的参与者，具有足够的肾功能，由肌酸≤1.5×ULN或计算的肌酐清除率(CrCl)≥50mL/分钟定义(也可以使用GFR)

-使用符合当地避孕方法规定的避孕药(男性和女性)

-东部合作肿瘤协作组(ECOG PS)表现状态为0-1

患者可能因针对其NSCLC而进行的任何在先全身性细胞毒性化疗或任何靶向T细胞共调节蛋白的抗体或药物被排除在研究之外。

实施例7：实施例6所述的晚期不可切除的III期NSCLC患者治疗的治疗功效

如实施例6所述，将根据RECIST 1.1的无进展生存期(PFS)作为接受抗PD-L1/TGFβ阱与cCRT组合，然后抗-PD-L1/TGFβ阱治疗的参与者的主要终点进行测量。研究了各实施例的组间功效差异。

治疗功效也可以用另外的结果决定因素来测量。治疗功效的一项度量是总生存期(OS)，即从随机分组到计划评估的时间，例如59个月。最佳总体疗效(BOR)，这是从研究治疗开始到疾病进展/复发为止记录的最佳疗效，也可以用于进一步确定治疗功效。其他治疗功效的度量是通过评估基线时PD-L1的表达。另一个次要终点是安全性。研究其他终点以进一步确立治疗功效。例如，与基线相比，通过肿瘤体积分析评估肿瘤大小的变化，并通过PET扫描测量肿瘤代谢体积的变化。肺纤维化相对于基线的变化通过高分辨率CT扫描和肺功能测试进行测量。

覆盖从胸腔入口上方到耻骨联合的区域的胸部/腹部和骨盆对比增强计算机断层扫描(CT)是评估治疗功效的首选成像方式。参与者每8周进行一次放射成像检查，以评估参与者首次给药后长至24个月对研究干预的反应，除非疾病进展或退出研究，以先发生者为准。每隔8-12周进行一次后续扫描，直至进展，开始新治疗或死亡。

可通过检查血浆或肿瘤组织中的突变类型和数量(肿瘤突变负担(TMB))，并研究TMB与临床结果之间的相关性，评估临床疗效的潜在预测生物标志物。

研究其他探索性终点以进一步确立治疗功效。例如，根据实体瘤中与免疫相关的疗效评估标准(irRECIST)，循环肿瘤DNA(ctDNA)水平，免疫相关的最佳总体疗效(irBOR)和免疫相关的无进展生存期(irPFS)的变化。

考虑抗-PD-L1/TGFβ阱对未经治疗晚期不可切除的III期NSCLC患者有初始临床活性。接受治疗的患者表现出疾病缓解(如部分缓解、完全缓解、病情稳定)和/或生存期(如无进展生存期和/或总生存期)改善。考虑用抗PD-L1/TGFβ阱与相伴cCRT联合治疗然后抗PD-L1/TGFβ阱巩固治疗与用cCRT和与抗PD-L1/TGFβ阱匹配的安慰剂然后度伐鲁单抗治疗的患者相比，导致未经治疗的III期NSCLC患者更好的存活。

在一个示例性实施方式中，PD-L1表达是通过FDA批准的测试确定的(例如，(肿瘤比例评分(TPS)或VENTANA PD-L1(SP263)测定法))。在一个示例性实施方式中，抗PD-L1抗体用于确定在福尔马林固定，石蜡包埋的组织中的PD-L1蛋白表达。在一个示例性实施方式中，招募患者与PD-L1表达无关，并通过SP263测定法对PD-L1表达进行回顾性分级。在一个示例性实施方式中，在主要功效分析(分级对数秩检验，PD-L1分级Cox模型，PD-L1调整的Cox模型)中，将PD-L1数据(回顾性和前瞻性)视为敏感性分析，用于评估关于PFS和OS的治疗效果)。

在一个示例性实施方式中，化疗方案(例如，顺铂/培美曲塞)被用作研究中的分级因素。在一个示例性的实施方式中，通过静脉内给予顺铂/依托泊苷或卡铂/紫杉醇联合抗PD-L1/TGFβ阱，然后通过抗PD-L1/TGFβ阱治疗，来治疗被诊断为III期NSCLC(例如鳞状或非鳞状)的患者。在一个示例性的实施方式中，通过静脉内给予顺铂/依托泊苷联合抗PD-L1/TGFβ阱，然后通过抗PD-L1/TGFβ阱治疗，来治疗被诊断为具有非鳞状组织学的III期NSCLC患者。

总而言之，发现抗PD-L1/TGFβ阱与相伴cCRT是一种创新的一流的双功能融合蛋白，旨在同时靶向两种免疫抑制途径：PD-L1和TGF-β，从而治疗III期NSCLC，同时使与相伴放疗相关的纤维化发展最小化，并增加了患者III期NSCLC的转移开始时间和/或向远处转移的时间。

SEQ ID NO:1

分泌的抗PD-L1λ轻链的肽序列

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

SEQ ID NO:2

分泌的抗PDL1的H链的肽序列

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:3

分泌的抗PDL1/TGFβ阱H链的肽序列

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:4

抗PD-L1λ轻链从翻译起始密码子到翻译终止密码子的DNA序列(VL之前的前导序列是来自尿激酶纤溶酶原激活物的信号肽)

SEQ ID NO:5

从翻译起始密码子至翻译终止密码子的DNA序列(mVK SP前导序列：小写下划线；VH：大写字母；含K至A突变的IgG1m3：小写字母；(G4S)x4-G(SEQ ID NO:11)接头：粗体大写字母；TGFβRII：粗体下划线小写字母；两个终止密码子：粗体下划线大写字母)

SEQ ID NO:6

分泌的抗PD-L1(mut)/TGFβ阱λ轻链的多肽序列，具有突变A31G，D52E，R99Y

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTYVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

SEQ ID NO:7

分泌的抗PD-L1(mut)/TGFβ阱重链的多肽序列

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYMMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:8

人TGFβRII同种型A前体多肽(NCBI RefSeq登录号：NP_001020018)

MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQQKLSSTWETGKTRKLMEFSEHCAIILEDDRSDISSTCANNINHNTELLPIELDTLVGKGRFAEVYKAKLKQNTSEQFETVAVKIFPYEEYASWKTEKDIFSDINLKHENILQFLTAEERKTELGKQYWLITAFHAKGNLQEYLTRHVISWEDLRKLGSSLARGIAHLHSDHTPCGRPKMPIVHRDLKSSNILVKNDLTCCLCDFGLSLRLDPTLSVDDLANSGQVGTARYMAPEVLESRMNLENVESFKQTDVYSMALVLWEMTSRCNAVGEVKDYEPPFGSKVREHPCVESMKDNVLRDRGRPEIPSFWLNHQGIQMVCETLTECWDHDPEARLTAQCVAERFSELEHLDRLSGRSCSEEKIPEDGSLNTTK

SEQ ID NO:9

人TGFβRII同种型B前体多肽(NCBI RefSeq登录号：NP_003233)

MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQQKLSSTWETGKTRKLMEFSEHCAIILEDDRSDISSTCANNINHNTELLPIELDTLVGKGRFAEVYKAKLKQNTSEQFETVAVKIFPYEEYASWKTEKDIFSDINLKHENILQFLTAEERKTELGKQYWLITAFHAKGNLQEYLTRHVISWEDLRKLGSSLARGIAHLHSDHTPCGRPKMPIVHRDLKSSNILVKNDLTCCLCDFGLSLRLDPTLSVDDLANSGQVGTARYMAPEVLESRMNLENVESFKQTDVYSMALVLWEMTSRCNAVGEVKDYEPPFGSKVREHPCVESMKDNVLRDRGRPEIPSFWLNHQGIQMVCETLTECWDHDPEARLTAQCVAERFSELEHLDRLSGRSCSEEKIPEDGSLNTTK

SEQ ID NO:10

人TGFβRII同种型B胞外域多肽

IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:11

(Gly

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG

SEQ ID NO:12

分泌的抗PD-L1抗体MPDL3289A重链可变区的多肽序列

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:13

分泌的抗PD-L1抗体MPDL3289A轻链可变区的多肽序列

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR

SEQ ID NO:14

分泌的抗PD-L1抗体YW243.55S70重链可变区的多肽序列

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA

SEQ ID NO:50

截短的人TGFβRII同种型B细胞外结构域多肽

GAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:51

截短的人TGFβRII同种型B细胞外结构域多肽

VKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:52

截短的人TGFβRII同种型B胞外域多肽

VTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:53

截短的人TGFβRII同种型B胞外域多肽

LCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:54

突变的人TGFβRII同种型B胞外域多肽

VTDNAGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:55

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS

SEQ ID NO:56

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO:57

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:58

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:59

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO:60

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:61

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGA

SEQ ID NO:62

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

通过引用纳入

本文提及的每篇专利文献和科学论文的全部公开内容通过援引纳入本文用于所有目的。

等同形式

在不脱离本公开的精神或基本特征的情况下，本发明可以其他特定形式实施。因此，前述实施例在所有方面都被认为是说明性的而不是限制本文所述的公开内容。不同实施例中的各种结构元件和所述各种方法步骤可以任意组合排列而所有这些变型都应视为本公开的方式。因此由附加的权利要求而不是前面描述指示发明的范围，并且因此意味着包含与权利要求等同含义和范围之内的所有改变。

序列表

<110> 默克专利有限公司（MERCK PATENT GMBH）

<120> III期NSCLC治疗和与治疗相关的病理状况缓解

<130> EMD-010WO

<150> 62/684,385

<151> 2018-06-13

<150> 62/800,808

<151> 2019-02-04

<150> 62/855,170

<151> 2019-05-31

<160> 62

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 1

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 2

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 2

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 3

<211> 607

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 3

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val

465 470 475 480

Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro

485 490 495

Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln

500 505 510

Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro

515 520 525

Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr

530 535 540

Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile

545 550 555 560

Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys

565 570 575

Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn

580 585 590

Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

595 600 605

<210> 4

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 4

atgagggccc tgctggctag actgctgctg tgcgtgctgg tcgtgtccga cagcaagggc 60

cagtccgccc tgacccagcc tgcctccgtg tctggctccc ctggccagtc catcaccatc 120

agctgcaccg gcacctccag cgacgtgggc ggctacaact acgtgtcctg gtatcagcag 180

caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtgt ccaaccggcc ctccggcgtg 240

tccaacagat tctccggctc caagtccggc aacaccgcct ccctgaccat cagcggactg 300

caggcagagg acgaggccga ctactactgc tcctcctaca cctcctccag caccagagtg 360

ttcggcaccg gcacaaaagt gaccgtgctg ggccagccca aggccaaccc aaccgtgaca 420

ctgttccccc catcctccga ggaactgcag gccaacaagg ccaccctggt ctgcctgatc 480

tcagatttct atccaggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ctgatggctc cccagtgaag 540

gccggcgtgg aaaccaccaa gccctccaag cagtccaaca acaaatacgc cgcctcctcc 600

tacctgtccc tgacccccga gcagtggaag tcccaccggt cctacagctg ccaggtcaca 660

cacgagggct ccaccgtgga aaagaccgtc gcccccaccg agtgctcatg a 711

<210> 5

<211> 1887

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 5

atggaaacag acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg ctccacaggc 60

gaggtgcagc tgctggaatc cggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 120

tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacatca tgatgtgggt gcgacaggcc 180

cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcctcc atctacccct ccggcggcat caccttctac 240

gccgacaccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 300

ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggatcaag 360

ctgggcaccg tgaccaccgt ggactactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 420

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 720

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260

ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380

cagaagagcc tctccctgtc cccgggtgct ggcggcggag gaagcggagg aggtggcagc 1440

ggtggcggtg gctccggcgg aggtggctcc ggaatccctc cccacgtgca gaagtccgtg 1500

aacaacgaca tgatcgtgac cgacaacaac ggcgccgtga agttccctca gctgtgcaag 1560

ttctgcgacg tgaggttcag cacctgcgac aaccagaagt cctgcatgag caactgcagc 1620

atcacaagca tctgcgagaa gccccaggag gtgtgtgtgg ccgtgtggag gaagaacgac 1680

gaaaacatca ccctcgagac cgtgtgccat gaccccaagc tgccctacca cgacttcatc 1740

ctggaagacg ccgcctcccc caagtgcatc atgaaggaga agaagaagcc cggcgagacc 1800

ttcttcatgt gcagctgcag cagcgacgag tgcaatgaca acatcatctt tagcgaggag 1860

tacaacacca gcaaccccga ctgataa 1887

<210> 6

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 6

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 7

<211> 607

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 7

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr

20 25 30

Met Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val

465 470 475 480

Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro

485 490 495

Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln

500 505 510

Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro

515 520 525

Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr

530 535 540

Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile

545 550 555 560

Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys

565 570 575

Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn

580 585 590

Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

595 600 605

<210> 8

<211> 592

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 8

Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu

1 5 10 15

Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp

20 25 30

Val Glu Met Glu Ala Gln Lys Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn

35 40 45

Arg Thr Ala His Pro Leu Arg His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr

50 55 60

Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp

65 70 75 80

Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys

85 90 95

Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val

100 105 110

Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp

115 120 125

Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro

130 135 140

Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met

145 150 155 160

Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu

165 170 175

Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln Val

180 185 190

Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val Ile

195 200 205

Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser

210 215 220

Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys Leu Met Glu Phe Ser Glu His

225 230 235 240

Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys

245 250 255

Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp

260 265 270

Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu

275 280 285

Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu Thr Val Ala Val Lys Ile Phe

290 295 300

Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser

305 310 315 320

Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu

325 330 335

Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe

340 345 350

His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr Leu Thr Arg His Val Ile Ser

355 360 365

Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala

370 375 380

His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile

385 390 395 400

Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu

405 410 415

Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr

420 425 430

Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg

435 440 445

Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser Arg Met Asn Leu Glu Asn Val

450 455 460

Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr Ser Met Ala Leu Val Leu Trp

465 470 475 480

Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu

485 490 495

Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu His Pro Cys Val Glu Ser Met

500 505 510

Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe

515 520 525

Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu

530 535 540

Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala

545 550 555 560

Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser

565 570 575

Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys

580 585 590

<210> 9

<211> 567

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 9

Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu

1 5 10 15

Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val

20 25 30

Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro

35 40 45

Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln

50 55 60

Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro

65 70 75 80

Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr

85 90 95

Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys

115 120 125

Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn

130 135 140

Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu

145 150 155 160

Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu

165 170 175

Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn

180 185 190

Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys

195 200 205

Leu Met Glu Phe Ser Glu His Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg

210 215 220

Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu

225 230 235 240

Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala

245 250 255

Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu

260 265 270

Thr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys

275 280 285

Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile

290 295 300

Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln

305 310 315 320

Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr

325 330 335

Leu Thr Arg His Val Ile Ser Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser

340 345 350

Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys

355 360 365

Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn

370 375 380

Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu

385 390 395 400

Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser

405 410 415

Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser

420 425 430

Arg Met Asn Leu Glu Asn Val Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr

435 440 445

Ser Met Ala Leu Val Leu Trp Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val

450 455 460

Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu

465 470 475 480

His Pro Cys Val Glu Ser Met Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly

485 490 495

Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met

500 505 510

Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg

515 520 525

Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu

530 535 540

Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp

545 550 555 560

Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys

565

<210> 10

<211> 136

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 10

Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr

1 5 10 15

Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp

20 25 30

Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys

35 40 45

Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val

50 55 60

Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp

65 70 75 80

Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro

85 90 95

Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met

100 105 110

Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu

115 120 125

Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

130 135

<210> 11

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly

20

<210> 12

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 14

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 15

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 15

Gln Phe Asn Ser

1

<210> 16

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 16

Gln Ala Gln Ser

1

<210> 17

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 17

Pro Lys Ser Cys Asp Lys

1 5

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 18

Pro Lys Ser Ser Asp Lys

1 5

<210> 19

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 19

Leu Ser Leu Ser

1

<210> 20

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 20

Ala Thr Ala Thr

1

<210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Lys, Arg, Thr, Gln, Gly, Ala, Trp, Met, Ile或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Val, Arg, Lys, Leu, Met或Ile

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> His, Thr, Asn, Gln, Ala, Val, Tyr, Trp, Phe或Met

<400> 21

Xaa Tyr Xaa Met Xaa

1 5

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Phe或Ile

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> Ser或Thr

<400> 22

Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Xaa Thr Phe Tyr Ala Asp Xaa Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> Glu或Asp

<400> 23

Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Xaa Tyr

1 5 10

<210> 24

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 24

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 25

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 25

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 26

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 26

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 27

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 28

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Asn或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Thr, Arg或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> Ala或Gly

<400> 28

Thr Gly Thr Xaa Xaa Asp Val Gly Xaa Tyr Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Glu或Asp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Ile, Asn或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Asp, His或Asn

<400> 29

Xaa Val Xaa Xaa Arg Pro Ser

1 5

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Phe或Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Asn或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Arg, Thr或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Gly或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Ile或Thr

<400> 30

Ser Ser Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val

1 5 10

<210> 31

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 31

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys

20

<210> 32

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 32

Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 33

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 33

Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 34

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 34

Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

1 5 10

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 35

Ser Tyr Ile Met Met

1 5

<210> 36

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 36

Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 37

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 37

Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr

1 5 10

<210> 38

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 38

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 39

Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 40

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 40

Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val

1 5 10

<210> 41

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 41

Met Tyr Met Met Met

1 5

<210> 42

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 42

Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 43

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 43

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 44

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 44

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ile Met Met Val Trp Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Trp Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 45

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 45

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 46

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 46

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr

20 25 30

Met Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Val Trp

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 47

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 47

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 48

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：来自人Fab文库的合成多核苷酸

<400> 48

atggagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgctag ctccagcgag 60

gtgcagctgc tggaatccgg cggaggactg gtgcagcctg gcggctccct gagactgtct 120

tgcgccgcct ccggcttcac cttctccagc tacatcatga tgtgggtgcg acaggcccct 180

ggcaagggcc tggaatgggt gtcctccatc tacccctccg gcggcatcac cttctacgcc 240

gacaccgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 300

cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gatcaagctg 360

ggcaccgtga ccaccgtgga ctactggggc cagggcaccc tggtgacagt gtcctccgcc 420

tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcacg ggatgagctg 1140

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260

gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380

aagagcctct ccctgtcccc gggtaaa 1407

<210> 49

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：来自人Fab文库的合成多核苷酸

<400> 49

atggagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cttaagccag 60

tccgccctga cccagcctgc ctccgtgtct ggctcccctg gccagtccat caccatcagc 120

tgcaccggca cctccagcga cgtgggcggc tacaactacg tgtcctggta tcagcagcac 180

cccggcaagg cccccaagct gatgatctac gacgtgtcca accggccctc cggcgtgtcc 240

aacagattct ccggctccaa gtccggcaac accgcctccc tgaccatcag cggactgcag 300

gcagaggacg aggccgacta ctactgctcc tcctacacct cctccagcac cagagtgttc 360

ggcaccggca caaaagtgac cgtgctgggc cagcccaagg ccaacccaac cgtgacactg 420

ttccccccat cctccgagga actgcaggcc aacaaggcca ccctggtctg cctgatctca 480

gatttctatc caggcgccgt gaccgtggcc tggaaggctg atggctcccc agtgaaggcc 540

ggcgtggaaa ccaccaagcc ctccaagcag tccaacaaca aatacgccgc ctcctcctac 600

ctgtccctga cccccgagca gtggaagtcc caccggtcct acagctgcca ggtcacacac 660

gagggctcca ccgtggaaaa gaccgtcgcc cccaccgagt gctca 705

<210> 50

<211> 117

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 50

Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe

1 5 10 15

Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr

20 25 30

Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys

35 40 45

Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu

50 55 60

Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile

65 70 75 80

Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys

85 90 95

Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn

100 105 110

Thr Ser Asn Pro Asp

115

<210> 51

<211> 115

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 51

Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr

1 5 10 15

Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile

20 25 30

Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp

35 40 45

Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr

50 55 60

His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys

65 70 75 80

Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser

85 90 95

Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser

100 105 110

Asn Pro Asp

115

<210> 52

<211> 122

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 52

Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe

1 5 10 15

Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser

20 25 30

Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val

35 40 45

Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys

50 55 60

His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala

65 70 75 80

Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe

85 90 95

Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe

100 105 110

Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

115 120

<210> 53

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 53

Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys

1 5 10 15

Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln

20 25 30

Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu

35 40 45

Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu

50 55 60

Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro

65 70 75 80

Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp

85 90 95

Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

100 105 110

<210> 54

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 54

Val Thr Asp Asn Ala Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe

1 5 10 15

Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser

20 25 30

Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val

35 40 45

Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys

50 55 60

His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala

65 70 75 80

Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe

85 90 95

Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe

100 105 110

Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

115 120

<210> 55

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 55

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Asp

20 25 30

Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 56

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 56

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr His

20 25 30

Ser Asn Gln Lys His Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 57

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 57

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 58

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 58

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 59

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 59

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Asp

20 25 30

Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 60

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 60

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr His

20 25 30

Ser Asn Gln Lys His Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 61

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 61

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Ala

435 440 445

<210> 62

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 62

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215