用于治疗的工程化成纤维细胞生长因子变体与工程化肝细胞生长因子变体的组合

摘要

本发明提供了用于治疗的多肽变体，特别是用于联合治疗角膜上皮缺损(PCED)和/或角膜血管新生的成纤维细胞生长因子(FGF)变体和肝细胞生长因子(HGF)变体。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年10月09日提交的标题为“Engineered Fibroblast GrowthFactor Variants Combined With Engineered Hepatocyte Growth Factor VariantsFor Treatment(用于治疗的工程化成纤维细胞生长因子变体与工程化肝细胞生长因子变体的组合)”的美国临时专利申请第62/743,416号的优先权，该美国临时专利申请的全部内容由此以引用方式并入。

技术领域

本发明涉及用于治疗的多肽变体的领域，特别是用于联合使用的成纤维细胞生长因子(FGF)变体和肝细胞生长因子(HGF)变体。

背景技术

人类生长因子在统筹许多复杂过程中起着关键作用，所述许多复杂过程为例如创伤愈合、组织再生、血管生成和肿瘤形成

关于眼睛，尽管其作为眼睛的圆顶状、最外组织的保护作用，但通常透明的角膜作为损伤或疾病的结果而极易发生溃疡、瘢痕形成和浑浊化。在严重的角膜损伤和疾病中，尽管有许多但主要是支持性的措施是当前可用的，但经常会接着发生永久性瘢痕形成和视力丧失。

对于eHGF和抗FGFR的组合，角膜血管新生是未满足的目标需求，基于马萨诸塞州眼和耳/哈佛医学院研究(Massachusetts Eye and Ear/Harvard Medical School study)中公布的4.14％发生率的推算，这每年影响估计140万患者。异常的角膜血管新生—没有用于其的经FDA批准的治疗—通常作为PCED的晚期或严重表现发生和/或作为经由创伤或疾病而导致的角膜外围上的上皮干细胞的损失或破坏发生。这方面的典型示例是化学角膜灼伤，这影响每100,000人中的10.7人(占所有眼部创伤的11.5％-22.1％)，其中外周干细胞被严重耗竭，从而导致延迟的愈合和到角膜上的血管生长。化学灼伤，尤其是碱灼伤，可论证地是眼睛遭受的最具破坏性的损伤，并且尽管目前所有(主要是支持性的)措施可用，但是其几乎无一例外地通过角膜和结膜的瘢痕化、角质化、浑浊化和血管新生而导致失明。因此，它是所建议的eHGF/抗FGFR联合疗法所靶向的多种途径以及所建立的动物模型的理想目标，在所述建立的动物模型中已证明它们的组合在抑制血管新生和纤维化的同时促进上皮形成(图40)。除角膜化学灼伤外，还有许多其他原因的角膜血管新生，所述角膜血管新生目前尚无治疗方法，但潜在地可通过eHGF/抗FGFR组合技术解决，所述角膜血管新生包括史蒂文斯-约翰逊综合征、角膜缘干细胞缺损，以及甚至接触镜过度配戴，所有这些在它们的核心都代表了透明的、无血管的角膜和与其相邻的高度血管化结膜组织之间的屏障的折衷。这种联合疗法将改善重组肝细胞生长因子(rHGF)

本发明通过提供用于治疗和/或预防持续性角膜上皮缺损(PCED)以及角膜血管新生的包含成纤维细胞生长因子(FGF)变体和肝细胞生长因子(HGF)变体的联合疗法的方法来满足该需求。

发明内容

本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗和/或预防持续性角膜上皮缺损(PCED)的方法，所述方法包括向所述受试者施用人肝细胞生长因子(hHGF)变体和人成纤维细胞生长因子1(FGF1)变体，从而治疗所述PCED。

本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗、减少和/或预防角膜血管新生的方法，所述方法包括向所述受试者施用hHGF变体和FGF1变体，从而治疗、减少和/或预防所述角膜血管新生。

在一些实施方案中，所述FGF1包含选自由以下组成的组的至少一个成员：氨基酸取代、氨基酸缺失、氨基酸添加以及它们的组合，其中与SEQ ID NO:1的野生型FGF1相比，所述所得FGF1变体表现出增加的蛋白水解稳定性。

在一些实施方案中，所述FGF1变体在β环中或C末端附近包含氨基酸取代、氨基酸缺失、氨基酸添加以及它们的组合。

在一些实施方案中，所述FGF1变体是成纤维细胞生长因子受体(FGFR)拮抗剂。

在一些实施方案中，所述FGF1变体在28位、40位、47位、93位或131位处包含至少一个氨基酸取代。

在一些实施方案中，所述FGF1变体包含选自由以下组成的组的至少一个氨基酸取代：D28N、Q40P、S47I、H93G、L131R、和L131K。

在一些实施方案中，FGF1变体包含氨基酸取代L131R。

在一些实施方案中，FGF1变体包含氨基酸取代L131K。

在一些实施方案中，FGF1变体包含氨基酸取代D28N和L131R。

在一些实施方案中，FGF1变体包含氨基酸取代D28N和L131K。

在一些实施方案中，FGF1变体包含氨基酸取代Q40P、S47I、H93G和L131R。

在一些实施方案中，FGF1变体包含氨基酸取代Q40P、S47I、H93G和L131K。

在一些实施方案中，FGF1变体包含氨基酸取代D28N、Q40P、S47I、H93G和L131R。

在一些实施方案中，FGF1变体包含氨基酸取代D28N、Q40P、S47I、H93G和L131K。

在一些实施方案中，FGF1变体不包含氨基酸取代L131A。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO:8的野生型hHGF相比，所述hHGF变体包含选自由以下组成的组的至少一个成员：氨基酸取代、氨基酸缺失、氨基酸添加以及它们的组合。

在一些实施方案中，hHGF变体在62位、127位、137位、170位或193位处包含至少一个氨基酸取代。

在一些实施方案中，hHGF变体包含选自由以下组成的组的至少一个氨基酸取代：K62E、N127D/A/K/R、K137R、K170E、和N193D。

在一些实施方案中，hHGF变体包含氨基酸取代K62E、N127D/A/K/R、K137R、K170E、和N193D。

在一些实施方案中，hHGF变体是Met的拮抗剂。

在一些实施方案中，hHGF变体是Met的激动剂。

在一些实施方案中，所述hHGF变体缀合至选自由以下组成的组的成员：可检测部分、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、治疗部分、靶向部分以及它们的组合。

在一些实施方案中，所述hHGF变体还包含在64位、77位、95位、125位、130位、132位、142位、148位、154位和173位中的一者或多者处的氨基酸取代。

在一些实施方案中，所述hHGF变体包含选自由图41中提供的来自美国专利第9,556,248号的SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:22组成的组的序列)。

在一些实施方案中，所述hHGF变体包含氨基酸取代K62E、Q95R、I125T、N127D/A/K/R、I130V、K132N/R、K137R、K170E、Q173R、和N193D。

在一些实施方案中，所述hHGF变体还包含在64位、77位、142位、148位和154位中的一者或多者处的氨基酸取代。

在一些实施方案中，所述hHGF变体包含氨基酸取代K62E、Q95R、K132N、K137R、K170E、Q173R、和N193D。

在一些实施方案中，所述hHGF变体还包含在64位、77位、125位、127位、130位、142位、148位和154位中的一者或多者处的氨基酸取代。

在一些实施方案中，所述hHGF变体包含氨基酸取代K62E、Q95R、N127D/A/K/R、K132N/R、K137R、K170E、Q173R、和N193D。

在一些实施方案中，所述hHGF变体还包含在64位、77位、125位、130位、142位、148位和154位中的一者或多者处的氨基酸取代。

在一些实施方案中，所述hHGF变体包含选自由SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:22组成的组的序列。

在一些实施方案中，所述HGF变体是激动剂并且所述FGF1变体是拮抗剂。

附图说明

图1.用于工程化蛋白水解稳定性的生长因子的酵母展示。感兴趣的生长因子(growth factor，GF)表达为与粘附蛋白凝集素Aga2p的融合体，所述粘附蛋白凝集素Aga2p通过两个二硫键附接至细胞壁蛋白Aga1p。在与蛋白酶一起孵育时，切割可以在生长因子内发生(生长因子特异性切割)，或在酵母展示蛋白Aga1p或Aga2p内发生(非特异性切割)。与生长因子受体的可溶性Fc融合体(GFR-Fc)一起孵育后，可以使用荧光抗体对HA标签、c-myc标签和Fc结构域进行染色。HA信号用于测量生长因子的基础表达水平和蛋白酶的非特异性切割。c-myc信号连同HA信号一起测量GF特异性切割。Fc信号用于测量GF变性的水平和GF对其受体的结合亲和力。

图2.用于蛋白水解稳定的生长因子突变体的基于FACS的筛选方法。将生长因子突变体文库转化到EBY100酵母细胞中，并通过酵母展示诱导以展示生长因子。将细胞与蛋白酶一起孵育，洗涤，然后与受体的可溶性Fc融合体一起孵育。用适当的荧光抗体标记后，使用流式活化细胞分选(flow activated cell sorting，FACS)来选通并收集表达具有低蛋白水解切割水平和与可溶性受体的高结合水平的突变体的细胞。将孵育和细胞分选的这种过程循环多次，以鉴定具有最高蛋白水解稳定性水平的突变体。

图3.FGF1的酵母展示。(A)FGF1表达为与粘附蛋白凝集素Aga2p的融合体，所述粘附蛋白凝集素Aga2p通过两个二硫键附接至细胞壁蛋白Aga1p。FGFR1-Fc是与FGF1结合的对应可溶性受体。(B)c-myc标签的荧光标记显示FGF1在酵母表面上成功表达。(C)FGFR1的Fc融合体显示出与经酵母展示的FGF1的特异性结合。将表达经表面展示的FGF1的酵母与可溶性FGFR1-Fc一起在各种浓度下孵育3小时。将细胞洗涤，并用抗Fc AlexaFluor488进行可溶性FGFR1-Fc染色。通过流式细胞术测量同与酵母细胞结合相关联的荧光并作图。

图4.用胎牛血清进行蛋白水解稳定性测定。将展示FGF1突变体文库的酵母细胞与不同浓度的胎牛血清一起孵育。在洗涤细胞并与10nM FGFR1-Fc一起孵育后，将细胞用针对c-myc和可溶性受体的Fc结构域的荧光抗体进行染色。通过流式细胞术进行的分析表明，增加FBS的浓度对FGF1特异性切割信号以及FGFR1-Fc结合信号的影响相对较小。

图5.用胰蛋白酶进行蛋白水解稳定性测定。将展示FGF1的酵母细胞与不同浓度的胰蛋白酶一起孵育。在洗涤细胞并与10nM FGFR1-Fc一起孵育后，将细胞用针对c-myc和可溶性受体的Fc结构域的荧光抗体进行染色。通过流式细胞术进行的分析表明，增加胰蛋白酶的浓度导致经酵母展示的蛋白质的切割(降低的c-myc)和与FGFR1-Fc的结合的损失。

图6.用糜蛋白酶进行蛋白水解稳定性测定。将展示FGF1的酵母细胞与不同浓度的糜蛋白酶一起孵育。在洗涤细胞并与10nM FGFR1-Fc一起孵育后，将细胞用针对c-myc和可溶性受体的Fc结构域的荧光抗体进行染色。通过流式细胞术进行的分析表明，增加糜蛋白酶的浓度导致经酵母展示的蛋白质的切割(降低的c-myc)和与FGFR1-Fc的结合的损失。

图7A至图7B.通过胰蛋白酶对酵母展示蛋白Aga1和Aga2进行非特异性切割。将展示FGF1的酵母细胞与不同浓度的胰蛋白酶一起孵育。在洗涤后，将细胞用针对HA和c-myc的荧光抗体染色。通过流式细胞术进行的分析表明，增加胰蛋白酶的浓度导致HA信号的损失，表明酵母展示蛋白Aga1和Aga2的非特异性切割。

图8A至图8B.通过糜蛋白酶进行FGF1特异性切割。将展示FGF1的酵母细胞与不同浓度的胰蛋白酶一起孵育。在洗涤后，将细胞用针对HA和c-myc的荧光抗体染色。通过流式细胞术进行的分析表明，增加糜蛋白酶的浓度导致c-myc信号的损失，但不会导致HA信号的损失，表明发生了FGF1特异性切割。

图9.用纤溶酶进行蛋白水解稳定性测定。将展示FGF1的酵母细胞与不同浓度的纤溶酶一起孵育。在洗涤后，将细胞用针对HA和c-myc的荧光抗体染色。通过流式细胞术进行的分析表明有FGF1的浓度依赖性切割。

图10.通过纤溶酶进行FGF1特异性切割。将展示FGF1的酵母细胞和展示仅表达酵母展示蛋白Aga1和Aga2的空对照的酵母细胞与125nM纤溶酶一起孵育。在洗涤后，将细胞用针对HA和c-myc的荧光抗体染色。通过流式细胞术进行的分析表明，对于展示FGF1的酵母细胞，增加纤溶酶浓度会导致c-myc信号的损失，而对于展示空对照的酵母细胞，增加纤溶酶浓度则不会导致c-myc信号的损失。这证实了纤溶酶对经酵母展示的蛋白的切割是FGF1特异性的。

图11.通过区分野生型FGF1与蛋白水解稳定的PM2来验证蛋白水解稳定性的测定。纤溶酶使得能够在各种纤溶酶浓度下孵育2天后通过酵母表面展示来区分野生型FGF1和蛋白水解稳定的突变体(PM2)。这证明了基于纤溶酶的筛选鉴定新的蛋白水解稳定突变体的能力。

图12.种类1：FGFR1-Fc结合物的选择。(A)FGFR1-Fc结合物的筛选方法的示意图。诱导随机诱变文库以在酵母表面上表达FGF突变体。将细胞与10nM FGFR1-Fc一起孵育，洗涤，然后用荧光抗体针对表达(α-c-myc)和FGFR1结合(α-FGFR1-Fc)染色。荧光活化细胞分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)用于分析和选通表现出高c-myc信号和高FGFR1-Fc信号的细胞。(B)示出了FGF1的FACS点图。在点图上绘制的选通旁，示出了从总群体中收集的细胞的百分比。

图13.种类2：对FGF1特异性切割的抗性的选择。(A)种类2的筛选方法的示意图。诱导来自种类1的细胞表达，并与纤溶酶一起孵育。将细胞洗涤，然后用荧光抗体针对表达(α-HA)和对FGF1特异性切割的抗性(α-c-myc)进行染色。荧光活化细胞分选(FACS)用于分析和选通表现出通过HA表达信号归一化的高c-myc信号的细胞。(B)示出了FGF1的FACS点图。如所详述，将每个文库的来自种类1的细胞在各种浓度的纤溶酶中孵育达不同孵育时间。用红色突出显示用于选通和收集细胞以进行富集的最终条件。对于所有测试条件，绘制了相同选通。

图14.分离肽伪影。(A)示出了用于FGF1种类2文库的分选的FACS点图。以与种类2相同的方式施加对FGF1特异性切割的抗性的选择。在表现出明显更高的对蛋白水解切割(c-myc)抗性的细胞亚群周围绘制收集选通。(B)示出了从选通收集的突变体的蛋白质序列。大多数由短肽组成，所述短肽是随机诱变的伪影，并非衍生自FGF1。

图15.肽伪影不与FGFR1-Fc结合。将在细胞表面上表达RTTTS或HTTS肽的酵母细胞与10nM FGFR1-Fc一起孵育。将细胞用荧光抗体针对表达(α-c-myc)和结合(α-FGFR1-Fc)进行染色。没有检测到明显的结合信号，表明该肽不与FGFR1-Fc结合。

图16.种类3和种类4的示意图。诱导来自先前的细胞进行表达并与不同浓度的纤溶酶一起孵育，洗涤，并与FGFR1-Fc一起孵育。在最后洗涤后，将细胞用荧光抗体针对表达(α-HA)、对FGF1特异性切割的抗性(α-c-myc)和FGFR1结合(α-FGFR1-Fc)进行染色。荧光活化细胞分选(FACS)用于分析和选通表现出通过HA表达信号归一化的高c-myc信号和/或高FGFR1-Fc结合信号的细胞。

图17.种类3：对耐蛋白酶的FGFR1-Fc结合物的选择。将来自种类2的诱导细胞在指定浓度的纤溶酶中孵育12小时。在洗涤后，将细胞与10nM FGFR1-Fc一起孵育。在最后洗涤后，将细胞用荧光抗体针对表达(α-HA)和FGFR1结合(α-FGFR1-Fc)进行染色。荧光活化细胞分选(FACS)用于分析和选通表现出高HA信号和高FGFR1-Fc信号的细胞。示出了FGF1的FACS点图。在点图上绘制的选通旁，示出了从总群体中收集的细胞的百分比。底部小图：与1.25μM纤溶酶一起孵育24小时后，保持与FGFR1-Fc的结合。

图18.种类4：对耐蛋白酶的FGFR1-Fc结合物的选择。将来自种类3的诱导细胞在各种浓度的纤溶酶中孵育36小时。在洗涤后，将细胞与10nM FGFR1-Fc一起孵育。在最后洗涤后，将细胞用荧光抗体针对表达(α-c-myc)和FGFR1结合(α-FGFR1-Fc)进行染色。荧光活化细胞分选(FACS)用于分析和选通表现出高c-myc信号和高FGFR1-Fc信号的细胞。示出了FGF1的FACS点图。用红色突出显示用于选通和收集细胞以进行富集的最终条件。对于给定FGF的所有条件，绘制了相同选通。在点图上绘制的选通旁，示出了从总群体中收集的细胞的百分比。底部小图：与3.75μM纤溶酶一起孵育36小时后，保持与FGFR1-Fc的结合。

图19.FGF1结构上的BS4M1突变(PDB代码1E0O)。通过筛选确定的蛋白水解稳定性富集突变以蓝色突出显示。D28N突变位于稳定化六链β桶结构的三个β发夹(红色突出显示)中的一个中。L131R突变位于蛋白质的C末端附近，其中在N末端与C末端之间缺乏稳定化β发夹。

图20.可溶性野生型FGF1的重组表达。(A)通过非还原的考马斯染色凝胶(左)和针对FGF1的蛋白质印迹法(右)分析纯化的野生型FGF1。两个明显的条带表明存在FGF1单体(19.7kDa)和二聚体(39.4kDa)。(B)通过观察与经酵母展示的FGFR3构建体的特异性结合，证实FGF1的正确折叠。

图21.FGF2在pBAD载体中的重组表达。(A)通过还原考马斯染色凝胶(左)和针对FGF2的蛋白质印迹法(右)分析在pBAD中表达并纯化的野生型FGF2-His。两者均表明通过表达的FGF2聚集。(B)在pBAD中表达的FGF2-His无法与经酵母展示的FGFR3构建体结合。

图22.FGF2在pET28b载体中的重组表达。野生型FGF2和FGF2突变体(BS5M1、BS5M3、BS5M5)在pET28b载体中表达为与超折叠体(superfolder)GFP的融合体。通过还原考马斯染色凝胶(左)和针对FGF2的蛋白质印迹法(右)分析在pBAD中表达并纯化的野生型FGF2-His。野生型FGF2表达不佳，而FGF2突变体则显示出聚集和/或低聚化的迹象。

图23.野生型FGF2在pET32a载体中的重组表达。(A)FGF2在pET32a载体中表达为与硫氧还蛋白的融合体。用TEV切割并通过Ni-NTA和尺寸排阻色谱法纯化后，通过针对FGF2的蛋白质印迹法分析了该蛋白质。证实了FGF2(19.3kDa)的成功纯化。

图24.纤溶酶中FGF1 WT和BS4M1的蛋白水解稳定性测定。与野生型FGF1相比，FGF1BS4M1(D28N/L131R)突变体在纤溶酶中显示出更大的蛋白水解稳定性。将100ng FGF1与600nM纤溶酶一起在37℃下孵育达各种孵育时间。将经孵育的样品在针对FGF1的蛋白质印迹法的单独泳道上电泳，以测量每个时间点蛋白质降解的程度。红色箭头指示的蛋白质条带的条带强度通过图像分析进行定量，以测量残留蛋白质的量。将每种蛋白质的条带强度通过时间点t＝0归一化，并作图。

图25.纤溶酶中FGF1 WT、BS4M1、PM2和PM3的蛋白水解稳定性测定。将来自BS4M1的突变(D28N、L131R)与来自PM2的突变(Q40P、S47I、H93G)组合以创建PM3。与BS4M1或PM2相比，PM3在纤溶酶中显示出更高的蛋白水解稳定性。将125ng FGF1与各种浓度的纤溶酶在37℃下一起孵育48小时。将经孵育的样品在针对FGF1的蛋白质印迹法的单独泳道上电泳，以测量每个时间点蛋白质降解的程度。红色箭头指示的蛋白质条带的条带强度通过图像分析进行定量，以测量残留蛋白质的量。通过当与0μM纤溶酶一起孵育时每种构建体的蛋白质的量将条带强度归一化，并作图。

图26.胰蛋白酶中FGF1 WT和BS4M1的蛋白水解稳定性测定。与野生型FGF1相比，FGF1 BS4M1(D28N/L131R)突变体在胰蛋白酶中显示出更高的蛋白水解稳定性。将100ngFGF1以1:20摩尔比的胰蛋白酶比FGF1在37℃下孵育达不同孵育时间。将经孵育的样品在针对FGF1的蛋白质印迹法的单独泳道上电泳，以测量每个时间点蛋白质降解的程度。红色箭头指示的蛋白质条带的条带强度通过图像分析进行定量，以测量残留蛋白质的量。通过在时间点t＝0处每种构建体的蛋白质的量对条带强度进行归一化，并作图。

图27.纤溶酶中FGF1 WT、BS4M1、D28N和L131R的蛋白水解稳定性测定。与BS4M1相比，FGF1 L131R单突变体保留了其大部分蛋白水解稳定性。甚至与野生型FGF1相比，FGF1D28N单突变体也具有较低的蛋白水解稳定性。将100ng FGF1与各种浓度的纤溶酶一起在37℃下孵育48小时。将经孵育的样品在针对FGF1的蛋白质印迹法的单独泳道上电泳，以测量每个时间点蛋白质降解的程度。红色箭头指示的蛋白质条带的条带强度通过图像分析进行定量，以测量残留蛋白质的量。通过当与0μM纤溶酶一起孵育时每种构建体的蛋白质的量将条带强度归一化，并作图。

图28.纤溶酶中FGF1 WT、L131R、L131A和L131K的蛋白水解稳定性测定。与FGF1L131R相比，FGF1 L131K单突变体保留了其大部分蛋白水解稳定性。甚至与野生型FGF1相比，FGF1 L131A单突变体也具有较低的蛋白水解稳定性。将100ng FGF1与各种浓度的纤溶酶一起在37℃下孵育48小时。将经孵育的样品在针对FGF1的蛋白质印迹法的单独泳道上电泳，以测量每个时间点蛋白质降解的程度。红色箭头指示的蛋白质条带的条带强度通过图像分析进行定量，以测量残留蛋白质的量。通过当与0μM纤溶酶一起孵育时每种构建体的蛋白质的量将条带强度归一化，并作图。

图29.FGF1野生型和L131R突变体的ThermoFluor测定。一式三份地测量FGF1野生型和L131R突变体的解链温度，并作图。两种蛋白质的解链温度之间没有统计学上的显著差异

图30.MDA-MB-231培养物中FGF1野生型和L131R突变体的稳定性。与野生型FGF1相比，FGF1 L131R突变体在与MDA-MB-231一起培养时显示出更高的稳定性。将500ng的FGF1与MDA-Mb-231细胞一起在37℃下孵育达各种孵育时间。将经孵育的样品浓缩并在针对FGF1的蛋白质印迹法的单独泳道上电泳，以测量每个时间点蛋白质降解的程度。红色箭头指示的蛋白质条带的条带强度通过图像分析进行定量，以测量残留蛋白质的量。将每种蛋白质的条带强度通过时间点t＝0归一化，并作图。

图31.NIH3T3 ERK磷酸化测定。FGF1 L131R突变体通过野生型FGF1抑制NIH3T3ERK磷酸化。用FGF1野生型和/或各种浓度的FGF1 L131R突变体刺激NIH3T3细胞15小时。将细胞裂解，并在蛋白质印迹法上用抗磷酸ERK探测裂解物。通过图像分析对条带强度进行定量，以测量FGF途径活化的程度。底部小图：用FGF1野生型和/或各种浓度的FGF1 L131R突变体刺激NIH3T3细胞10小时。

图32.NIH3T3细胞中通过FGF1 L131R突变体抑制FGF1刺激的ERK磷酸化。将NIH3T3细胞与1nM FGF1和各种浓度的FGF1 L131R一起孵育。通过针对磷酸ERK的蛋白质印迹法来测量每种条件下ERK磷酸化的程度。通过图像分析对条带强度进行定量并作图以获得IC50值。

图33.FGF1野生型和L131R突变体与NIH3T3细胞的结合。His标记的FGF1 WT和L131R突变体与表达FGFR的NIH3T3细胞的平衡结合滴定。将细胞在4℃下与不同浓度的每种蛋白质一起孵育，并用抗His的荧光抗体染色以定量与细胞的结合。

图34A至图34B.提供了IgG1、IgG2、IgG3和IgG4序列的示例。

图35.HGF结构域的结构。N：N末端PAN模块；K：Kringle结构域；SPH：丝氨酸蛋白酶同源结构域。黑色箭头表示用于将HGF切割成其两链活性形式的切割位点。α链和β链通过二硫键连接。N末端和第一Kringle结构域构成HGF的NK1片段。

图36.酵母展示构建体pTMY-HA。(A)pTMY-HA的开放阅读框。蛋白质经显示有自由的N末端，并通过其C末端连接至Aga2p。(B)酵母表面展示的示意图。感兴趣的蛋白质(NK1)通过与Aga2p的N末端的遗传连锁而系留至酵母细胞壁。针对HA表位标签的抗体用于监测细胞表面表达，并且还监测与结合配偶体(在这种情况下为Met-Fc)的相互作用。

图37.NK1工程化策略的概述。在第一轮定向进化(M1)中，筛选文库中与Met的功能结合；对于第二轮(M2)，并行筛选文库中增强的亲和力或增强的稳定性；对于第三轮(M3)，将M2产品混洗并同时筛选提高的亲和力和稳定性。

图38.角膜的化学损伤通常会导致血管新生、瘢痕形成和失明。

图39.碱灼伤后的角膜创伤愈合研究，其比较了(A)t＝0小时时的角膜创伤，(B)在用HA/CS凝胶递送媒介物中的MSC分泌组处理后24小时的角膜创伤，(C)在单独的盐水滴注后24小时的角膜创伤。已经在初步工作中证明(D)单独的在Cochran实验室开发的eHGF(PDB结构在插图中示出)还可以体内加速大鼠碱灼伤角膜中的创伤闭合时间。

图40.(A)碱灼伤的角膜和(B)局部分泌组处理7天后的角膜。(C)碱灼伤的角膜和和(D)eHGF和抗FGF处理7天后的角膜。未经处理的角膜经瘢痕化和血管化，并且在一些情况下有出血的迹象。(E)在大鼠左眼碱灼伤后7天，大鼠双侧眼睛的外观。(F)在初始碱灼伤后，经过7天的eHGF和抗FGF处理，大鼠双侧眼睛的外观。

图41.提供了来自美国专利第9,556,248号的变异肝细胞生长因子序列SEQ IDNO:2至SEQ ID NO:22，该美国专利的全部内容以引用方式并入本文。

具体实施方式

I.

成纤维细胞生长因子是，参与多种过程，最显著地是作为正常发育的关键要素的细胞信号传导蛋白家族。这些生长因子通常作为活化细胞表面受体的细胞外起源的全身或局部循环分子。哺乳动物成纤维细胞生长因子受体家族具有4个成员，即FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4。FGFR由三个细胞外免疫球蛋白型结构域(D1-D3)、一个单跨跨膜结构域和一个细胞内分裂酪氨酸激酶结构域组成。FGF与D2和D3结构域相互作用，其中D3相互作用主要负责配体结合特异性(参见下文)。硫酸类肝素结合经由D3结构域介导。位于D1结构域与D2结构域之间的一小段酸性氨基酸具有自抑制功能。该“酸盒”基序与硫酸肝素结合位点相互作用，以防止在不存在FGF的情况下受体活化。每个FGFR与FGF的特定子集结合。类似地，大多数FGF可以结合几种不同的FGFR亚型。FGF1有时被称为‘通用配体’，因为它能够活化所有7种不同的FGFR。相比之下，FGF7(角化细胞生长因子，KGF)仅与FGFR2b(KGFR)结合。

本发明提供了用于组合方法的方法，所述组合方法使用酵母展示平台和流式活化细胞分选(FACS)进行筛选来工程化蛋白水解稳定的生长因子。描述了使用FGF1作为模型示例建立筛选方法的过程，并且提供了用于工程化示例性蛋白水解稳定的生长因子的方法。本发明还提供了蛋白水解稳定的FGF1突变体的表征。

II.

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。通常，本文所用的命名法以及细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交中的实验室工序是本领域中众所周知的和常用的那些。标准技术用于核酸和肽合成。所述技术和工序通常根据本领域中的常规方法和各种一般参考文献执行(一般参见Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，该文献以引用方式并入本文)，所述本领域中的常规方法和各种一般参考文献贯穿本文件提供。本文所用的命名法以及下文所述的分析和合成有机化学实验室工序是本领域中众所周知的和常用的那些。使用标准技术或其修改来进行化学合成和化学分析。

术语“M2.1”和“M2.2”是指分别具有以下取代的SEQ ID NO:2的变体：(i)K62E、N127D、K137R、K170E、N193D；以及(ii)K62E、Q95R、N127D、K132N、K137R、K170E、Q173R、N193D。

术语“BS4M1”和“PM2”以及“PM3”是指具有以下取代的SEQ ID NO:1的变体：(i)BS4M1(D28N和L131R)，(ii)PM2(Q40P、S47I、H93G)和(iii)PM3(D28N、Q40P、S47I、H93G、L131R)。FGF1：FNLPPGNYKKPKLLYCSNGGHFLRILPDGTVDGTRDRSDQHIQLQLSAESVGEVYIKSTETGQYLAMDTDGLLYGSQTPNEECLFLERLEENHYNTYISKKHAEKNWFVGLKKNGSCKRGPRTHYGQKAILFLPLPVSSD(SEQ ID NO:1)。SEQ ID NO:1是没有前肽的FGF1序列(位于万维网上的uniprot.org/blast/？about＝P05230[16-155]&key＝Chain&id＝PRO_0000008908)。本文所述的编号是基于将以上序列的第一氨基酸作为1位(例如：F1、N2等)。FGF1的其他编号可以在编号中包含前肽序列，这会导致编号增大14。然而，本文的编号基于SEQ ID NO:1并且不包括FGF1前肽。

术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)或核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)以及它们的聚合物。除非特别限制，否则该术语涵盖含有已知天然核苷酸类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式被代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列还暗含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过生成这样的序列来实现，在所述序列中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA和由基因编码的mRNA互换使用。此外，如本文所用，编码本发明的多肽变体的核酸被定义为包括与该核酸序列互补的核酸序列。

术语“基因”是指参与产生多肽链的DNA区段。它可包括编码区之前和之后的区域(前导区和尾区)以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

当应用于核酸或蛋白质时，术语“分离的”是指该核酸或蛋白质基本上不含在自然状态下与之缔合的其他细胞组分。尽管其可以是干燥或水溶液形式，但优选为均质状态。纯度和均一性通常使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法的分析化学技术测定。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质是基本上纯化的。具体地，分离的基因与位于该基因侧翼并编码除该感兴趣的基因以外的蛋白质的开放阅读框分离。术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一条条带(band)。具体地，这意味着核酸或蛋白质至少85％纯的，更优选至少95％纯的，最优选至少99％纯的。分离的核酸可以是表达载体的组分。

通常，本发明的分离多肽具有优选表示为范围的纯度水平。多肽的纯度范围的下限为约60％、约70％或约80％，并且纯度范围的上限为约70％、约80％、约90％、约95％，或大于约95％。当多肽大于约90％纯时，它们的纯度也优选表示为范围。纯度范围的下限为约90％、约92％、约94％、约96％或约98％。纯度范围的上限为约92％、约94％、约96％、约98％或约100％的纯度。

纯度通过任何本领域公认的分析方法(例如，银染凝胶上的条带强度、聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC、质谱或类似手段)确定。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后期经修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即，结合至氢的α碳、羧基、氨基和R基团，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指具有这样的结构的化合物，所述结构不同于氨基酸的一般化学结构，但其以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用。

“亲水性氨基酸”是指根据Eisenberg等人，1984,J.Mol.Biol.179:125-142的归一化的共有疏水性量表，表现出小于零的疏水性的氨基酸。遗传编码的亲水性氨基酸包括Thr(T)、Ser(S)、His(H)、Glu(E)、Asn(N)、Gln(Q)、Asp(D)、Lys(K)和Arg(R)。

“酸性氨基酸”是指具有小于7的侧链pK值的亲水性氨基酸。由于失去氢离子，酸性氨基酸通常在生理pH下具有带负电的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括Glu(E)和Asp(D)。

“碱性氨基酸”是指具有大于7的侧链pK值的亲水性氨基酸。由于与水合氢离子缔合，碱性氨基酸通常在生理pH下具有带正电的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包括His(H)、Arg(R)和Lys(K)。

“极性氨基酸”是指这样的亲水性氨基酸，所述亲水性氨基酸在生理pH下具有不带电荷的侧链，但是具有至少一个键，在所述至少一个键中由两个原子共同共享的一对电子被所述原子中的一个原子更紧密地保持。遗传编码的极性氨基酸包括Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)和Thr(T)。

“疏水性氨基酸”是指根据Eisenberg,1984,J.Mol.Biol.179:125-142的归一化的共有疏水性量表，表现出大于零的疏水性的氨基酸。示例性疏水性氨基酸包括Ile(I)、Phe(F)、Val(V)、Leu(L)、Trp(W)、Met(M)、Ala(A)、Gly(G)、Tyr(Y)、Pro(P)、和脯氨酸类似物。

“芳族氨基酸”是指有具有至少一个芳族或杂芳族环的侧链的疏水性氨基酸。所述芳族或杂芳族环可含有一个或多个取代基，诸如-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-NO

“非极性氨基酸”是指这样的疏水性氨基酸，所述疏水性氨基酸具有在生理pH下不带电荷并且具有键的侧链，在所述键中由两个原子共同共享的一对电子通常被这两个原子中的每一个原子均等地保持(即，侧链不是极性的)。遗传编码的非极性氨基酸包括Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Met(M)、Gly(G)和Ala(A)。

“脂族氨基酸”是指具有脂族烃侧链的疏水性氨基酸。遗传编码的脂族氨基酸包括Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)。

氨基酸残基Cys(C)是不寻常，因为它可以与其他Cys(C)残基或其他含磺酰基的氨基酸形成二硫键桥。Cys(C)残基(和其他带有含-SH的侧链的氨基酸)以还原的游离-SH或氧化的二硫键桥接形式存在于肽中的能力会影响Cys(C)残基贡献净疏水性还是亲水性特征给肽。尽管Cys(C)表现出根据Eisenberg的归一化共有量表(Eisenberg,1984，出处同上)为0.29的疏水性，但是应当理解的是，尽管有上面定义的一般分类，但是出于本发明的目的，Cys(C)被归类为极性亲水性氨基酸。

术语“接头”是指共价连接两个或更多个多肽的氨基酸多肽间隔区。接头可以是1-15个氨基酸残基。优选地，接头是单个半胱氨酸残基。接头也可以具有氨基酸序列SEQ IDNO:1KESCAKKQRQHMDS。

如本领域技术人员应理解的，以上定义的类别不是相互排斥的。因此，具有表现出两种或更多种物理化学特性的侧链的氨基酸可以被包括在多个类别中。例如，具有进一步被极性取代基诸如Tyr(Y)取代的芳族部分的氨基酸侧链可同时表现出芳族疏水特性和极性或亲水特性，并且因此可包括在芳族类别和极性类别两者中。任何氨基酸的适当分类对于本领域技术人员将是显而易见的，尤其是根据本文提供的详细公开内容。

当被称为“螺旋破坏”氨基酸的某些氨基酸残基被包含在螺旋内的内部位置处时，它们具有破坏α螺旋结构的倾向。表现出这种螺旋破坏特性的氨基酸残基是本领域中众所周知的(参见例如，Chou和Fasman,Ann.Rev.Biochem.47:251-276)并且包括Pro(P)、Gly(G)和潜在的所有D-氨基酸(当包含在L-肽中时；反之，当L-氨基酸包含在D-肽中时，L-氨基酸会破坏螺旋结构)以及脯氨酸类似物。尽管这些螺旋破坏氨基酸残基落入上面定义的类别中，Gly(G)(在下文讨论)除外，但这些残基不应用于取代螺旋内的内部位置处的氨基酸残基—它们应仅用于取代肽的N末端和/或C末端处的1-3个氨基酸残基。

尽管已经根据遗传编码的氨基酸例示了上述类别，但是氨基酸取代不必是并且在某些实施方案中优选地不限于遗传编码的氨基酸。实际上，许多优选的式(I)的肽含有非遗传编码的氨基酸。因此，除了天然存在的遗传编码的氨基酸之外，式(I)的核心肽中的氨基酸残基可以被天然存在的非编码氨基酸和合成氨基酸取代。

提供对式(I)的核心肽的有用取代的某些常见氨基酸包括但不限于β-丙氨酸(β-Ala)和其他ω-氨基酸(诸如3-氨基丙酸、2,3-二氨基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸等)；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔丁基丙氨酸(t-BuA)；叔丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基异亮氨酸(MeIle)；苯甘氨酸(Phg)；环己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；萘基丙氨酸(Nal)；4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1/2/3/4-四氢异喹啉-3-甲酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；蛋氨酸亚砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰赖氨酸(AcLys)；2,4-二氨基丁酸(Dbu)；2,3-二氨基丁酸(Dab)；对氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)、高苯丙氨酸(hPhe)和高丝氨酸(hSer)；羟脯氨酸(Hyp)、高脯氨酸(hPro)、N-甲基化氨基酸和类肽(N-取代的甘氨酸)。另外，在一些实施方案中，式(I)的核心肽中的氨基酸脯氨酸被脯氨酸类似物所取代，所述脯氨酸类似物包括但不限于氮杂环丁烷-2-甲酸酯(azetidine-2-carboxylate，A2C)、L-噻唑烷-4-甲酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸(CHP)、3,4-脱氢脯氨酸、硫代脯氨酸和异六氢烟碱酸(Inp)。

氨基酸可以在本文中通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样地，核苷酸可以通过其普遍接受的单字母代码来提及。

关于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，会改变、添加或缺失经编码的序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域中众所周知的。此类保守修饰的变体是本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因的补充，并且不排除所述多态性变体、种间同源物和等位基因。

以下八个组各自含有针对彼此保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和

8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)

(参见例如，Creighton,Proteins(1984))。

氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到前述特征中的一者或多者的示例性取代是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于(原始残基：示例性取代)：(Ala：Gly、Ser)、(Arg：Lys)、(Asn：Gln、His)、(Asp：Glu、Cys、Ser)、(Gln：Asn)、(Glu：Asp)、(Gly：Ala)、(His：Asn、Gln)、(Ile：Leu、Val)、(Leu：Ile、Val)、(Lys：Arg)、(Met：Leu、Tyr)、(Ser：Thr)、(Thr：Ser)、(Tip：Tyr)、(Tyr：Trp、Phe)、和(Val：Ile、Leu)。因此，本公开的实施方案考虑了如上所述的多肽或蛋白质的功能或生物学等效物。具体地，本发明的实施方案提供了与亲本多肽具有约50％、60％、70％、80％、90％和95％序列同一性的变体。在各种实施方案中，本发明提供了与亲本多肽序列的一部分具有该同一性水平的变体，所述亲本多肽序列为例如野生型生长因子，包括例如野生型FGF1(SEQ ID NO:1)。在各种实施方案中，该变体与亲本多肽或亲本多肽序列的一部分具有至少约95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，所述亲本多肽或亲本多肽序列的一部分为例如野生型生长因子，包括例如野生型FGF1(SEQ ID NO:1)，如本文所定义。

“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。关于特定的核酸序列，“保守修饰的变体”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本上相同的序列。由于遗传密码简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个由密码子指定的丙氨酸位置处，可以在不改变编码的多肽的情况下将密码子改变为所述的任何对应密码子。这种核酸变异是“沉默变异”，这是保守修饰的变异中的一种种类。本文中编码多肽的每个核酸序列还描述了核酸的每种可能的沉默变体。本领域技术人员应认识到，可以修饰核酸中的每个密码子(AUG(其通常是蛋氨酸的唯一密码子)以及TGG(其通常是色氨酸的唯一密码子)除外)以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异都隐含在每个所述序列中。

如本领域中已知的，“同一性”是两个或更多个多肽或蛋白质序列之间的关系，如通过比较序列确定的。在本领域中，“同一性”还指多肽或蛋白质之间的序列相关性程度，如通过此类序列的字符串之间的匹配所确定的。“同一性”可以容易地通过已知的生物信息学方法来计算。

“肽”是指其中单体是氨基酸并且通过酰胺键接合在一起的聚合物。本发明的肽的大小可以变化，例如，从两个氨基酸到数百或数千个氨基酸。较大的肽(例如，至少10个、至少20个、至少30个或至少50个氨基酸残基)可替代地称为“多肽”或“蛋白质”。另外，还包括非天然氨基酸，例如β-丙氨酸、苯甘氨酸、高精氨酸和高苯丙氨酸。非基因编码的氨基酸也可以用于本发明中。此外，已经被修饰为包括反应性基团、糖基化序列、聚合物、治疗性部分、生物分子等的氨基酸也可以用于本发明中。用于本发明的所有氨基酸可以是d-异构体或l-异构体。通常优选的是l-异构体。另外，其他肽模拟物也可用于本发明。如本文所用，“肽”或“多肽”是指糖基化和非糖基化的肽或“多肽”。还包括被表达多肽的系统不完全糖基化的多肽。有关一般性综述，请参见Spatola,A.F.，Chemistry and Biochemistry ofAmino Acids,Peptides and Proteins,B.Weinstein编著,Marcel Dekker,New York,第267页(1983)。

在本申请中，氨基酸残基是根据它们相对于多肽的N末端氨基酸(例如，N末端蛋氨酸)的相对位置编号的(通常在上标中)，该N末端氨基酸被编号为“1”。N末端氨基酸可以是蛋氨酸(M)，编号为“1”。如果多肽的N末端开始时没有蛋氨酸，则可以容易地调节与每个氨基酸残基相关的数目以反映出N末端蛋氨酸的缺失。应当理解的是，示例性多肽的N末端可以以具有或不具有蛋氨酸开始。因此，在向野生型多肽的N末端添加氨基酸接头的情况下，与N末端氨基酸邻接的第一接头氨基酸是编号-1等。例如，如果接头具有氨基酸序列KESCAKKQRQHMDS(SEQ ID NO:2)，其中S残基与野生型多肽的N末端氨基酸邻接，则最N末端的接头氨基酸K将为-14，而最C末端接头氨基酸S将为-1。以这种方式，保留了野生型多肽和与接头结合的野生型多肽中的氨基酸的编号。

术语“亲本多肽”是指野生型多肽，并且该野生型多肽的氨基酸序列或核苷酸序列是公众可访问的蛋白质数据库(例如，EMBL核苷酸序列数据库、NCBI Entrez、ExPasy、蛋白质数据库等)的一部分。

术语“突变多肽”或“多肽变体”或“突变蛋白”或“变异多肽”是指多肽的一种形式，其中其氨基酸序列不同于其对应的野生型(亲本)形式、天然存在的形式或任何其他亲本形式的氨基酸序列。突变多肽可含有一个或多个突变，例如替换、插入、缺失等，所述一个或多个突变导致突变多肽。

术语“对应于亲本多肽”(或该术语的语法变型)用于描述本发明的多肽，其中该多肽的氨基酸序列仅通过存在至少一氨基酸变化而与对应的亲本多肽的氨基酸序列不同。通常，变异多肽和亲本多肽的氨基酸序列表现出高同一性百分比。在一个示例中，“对应于亲本多肽”是指变异多肽的氨基酸序列具有与亲本多肽的氨基酸序列至少约50％的同一性、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的同一性。在另一个示例中，编码变异多肽的核酸序列具有与编码亲本多肽的核酸序列至少约50％的同一性、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的同一性。在一些实施方案中，亲本多肽对应于SEQ ID NO:1的FGF1。

术语“将变异引入(或添加等)至亲本多肽中”(或其语法变型)，或“修饰亲本多肽”以包括变异(或其语法变型)，不一定意味着亲本多肽是作为用于这种转化的物理起始材料，而是亲本多肽提供了用于制备变异多肽的指导氨基酸序列。在一个示例中，“将变异引入亲本多肽中”是指通过适当的突变修饰亲本多肽的基因以产生编码变异多肽的核苷酸序列。在另一个示例中，“将变异引入亲本多肽中”是指使用亲本多肽序列作为指导来在理论上设计所得的多肽。然后可以通过化学或其他手段产生所设计的多肽。

如本文所用，“NK1”由肝细胞生长因子的N末端和第一Kringle结构域组成。本发明的多肽中的断裂点包括人肝细胞生长因子同种型1(Genbank登录号ID NP_000592)的氨基酸28-210。其他则使用31-210和32-210的断裂点。替代的人肝细胞生长因子同种型，同种型3(Genbank登录号ID NP_00101932.1)与人HGF(hHGF)同种型1相同，除了在第一Kringle结构域中缺失了5个氨基酸。hHGF同种型1和同种型3均有效活化Met受体，并且衍生自hHGF同种型1或同种型3的NK1蛋白也均结合并活化Met受体。基于同种型3变体的NK1的断裂点28-205、31-205和32-205将与基于同种型1变体的NK1的断裂点28-210、31-210和32-210相同，唯一的区别是从第一Kringle结构域(K1)中缺失了5个氨基酸。

术语“文库”是指不同多肽的集合，所述多肽各自对应于共同的亲本多肽。文库中的每种多肽种类都称为文库的成员。优选地，本发明的文库代表具有足够数量和多样性的多肽的集合，以提供从中鉴定前导多肽的群体。文库包含至少两种不同的多肽。在一个实施方案中，该文库包括约2至约100,000,000个成员。在另一实施方案中，该文库包括约10,000至约100,000,000个成员。在另一实施方案中，该文库包括约100,000至约100,000,000个成员。在又一实施方案中，该文库包括约1,000,000至约100,000,000个成员。在另一实施方案中，该文库包括约10,000,000至约100,000,000个成员。在又一实施方案中，该文库包括多于100个成员。

文库的成员可以是混合物的一部分，或者可以与彼此分离。在一个示例中，该文库的成员是混合物的一部分，该混合物任选地包含其他组分。例如，一定体积的细胞培养液中存在至少两种多肽。在另一示例中，文库的成员各自分开表达，并且可以任选地分离。分离的多肽可任选地包含在多孔容器中，在所述多孔容器中每个孔包含不同类型的多肽。在另一个示例中，文库的成员各自表达为与酵母或细菌细胞或噬菌体或病毒颗粒的融合体。

如本文所用，术语“聚合物修饰基团”是包含至少一个聚合物部分(聚合物)的修饰基团。添加到多肽上的聚合物修饰基团可以改变这种多肽的性质，例如其生物利用度、生物活性或其在体内的半衰期。示例性聚合物包括水溶性聚合物和水不溶性聚合物。聚合物修饰基团可以是直链或支链的，并且可以包括一个或多个独立选择的聚合物部分，诸如聚(亚烷基二醇)及其衍生物。在一个示例中，聚合物是非天然存在的。在一个示例性实施方案中，聚合物修饰基团包括水溶性聚合物，例如聚(乙二醇)及其衍生物(PEG、m-PEG)、聚(丙二醇)及其衍生物(PPG、m-PPG)等。在一个优选的实施方案中，聚(乙二醇)或聚(丙二醇)的分子量是基本上均相分散的。在一个实施方案中，聚合物修饰基团不是天然存在的多糖。

如本文所用，术语“靶向部分”是指将选择性地定位在身体的特定组织或区域中的物质。通过分子决定簇的特异性识别、靶向剂或缀合物的分子大小、离子相互作用、疏水相互作用等来介导定位。将剂靶向特定组织或区域的其他机制是本领域技术人员已知的。示例性的靶向部分包括抗体、抗体片段、转铁蛋白、HS-糖蛋白、凝血因子、血清蛋白、β-糖蛋白、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO等。

如本文所用，术语“Fc融合蛋白”意在包括蛋白质，特别是治疗性蛋白质，其包含免疫球蛋白来源的部分，该部分在本文中将被称为“Fc部分”；以及来源于非免疫球蛋白的第二蛋白的部分，该部分在本文中将被称为“治疗部分”，而与是否打算治疗疾病无关。

如本文所用，“治疗部分”是指可用于疗法的任何剂，包括但不限于抗生素、抗炎剂、抗肿瘤药、细胞毒素和放射性剂。“治疗部分”包括生物活性剂的前药、其中多于一个的治疗部分结合至载体的构建体，例如多价剂。

治疗部分还包括蛋白质和包含蛋白质的构建体。

如本文所用，“抗肿瘤药”是指可用于对抗癌症的任何剂，包括。

如本文所用，“细胞毒素或细胞毒性剂”是指对细胞有害的任何剂。示例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽醌二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普奈洛尔和嘌呤霉素，以及它们的类似物或同源物。其他毒素包括例如蓖麻毒素、CC-1065和类似物，以及倍癌霉素。其他毒素还包括白喉毒素和蛇毒(例如，眼镜蛇毒)。

如本文所用，“放射性剂”包括在诊断或破坏肿瘤方面有效的任何放射性同位素。示例包括但不限于铟-111、钴-60、氟-18、铜-64、铜-67、镥-177或锝-99m。另外，通常代表放射性同位素混合物的天然存在的放射性元素，例如铀、镭和钍，是放射性剂的合适示例。金属离子通常与有机螯合部分螯合。放射性剂或放射性核素可以是显像剂的组分。

对于光学成像应用，也可以使用标准化学方法对近红外染料进行缀合。“近红外”是指在电磁光谱的与可见光相关联的部分相邻的部分中的辐射，例如，从约0.7μm至约1μm。近红外染料可包括例如花菁或吲哚菁绿衍生物，例如Cy5.5。红外染料还可包括亚磷酰胺染料，例如

许多有用的螯合基团、冠醚、穴状配体等在本领域中是已知的，并且可以掺入本发明的化合物中(例如，EDTA、DTPA、DOTA、NTA、HDTA等，以及它们的膦酸酯类似物，诸如DTPP、EDTP、HDTP、NTP等)。参见例如，Pitt等人，“The Design of Chelating Agents for theTreatment of Iron Overload”，Inorganic Chemistry in Biology and Medicine；Martell编著；American Chemical Society,Washington,D.C.,1980,第279-312页；Lindoy,The Chemistry of Macrocyclic Ligand Complexes；Cambridge UniversityPress,Cambridge,1989；Dugas,Bioorganic Chemistry；Springer-Verlag,New York,1989，以及其中包含的参考文献。另外，允许将螯合剂、冠醚和环糊精附接到其他分子的多种途径是对本领域技术人员而言可用的。参见例如，Meares等人，“Properties of In VivoChelate-Tagged Proteins and Polypeptides.”Modification of Proteins:Food,Nutritional,and Pharmacological Aspects；Feeney等人编著，American ChemicalSociety,Washington,D.C.,1982,第370-387页；Kasina等人，Bioconjugate Chem.,9:108-117(1998)；Song等人，Bioconjugate Chem.,8:249-255(1997)。这些金属结合剂可用于结合在成像模态中可检测到的金属离子。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括当与缀合物组合时保留缀合物的活性并且与受试者的免疫系统不反应的任何材料。“药学上可接受的载体”包括固体和液体，例如媒介物、稀释剂和溶剂。示例包括但不限于任何标准药物载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂诸如油/水乳剂、和各种类型的润湿剂。其他载体还可以包括无菌溶液，包括包衣片剂在内的片剂、和胶囊。通常，此类载体包含赋形剂，例如淀粉、乳、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐，硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石、植物脂肪或油、树胶、乙二醇、或其他已知的赋形剂。此类载体还可包括调味剂和颜色添加剂或其他成分。通过众所周知的常规方法配制包含此类载体的组合物。

如本文所用，“施用”意指向受试者口服施用、作为栓剂施用、局部接触、静脉内、腹膜内、肌内、鞘内、病灶内、或皮下施用、通过吸入施用或植入缓释装置，例如，小型渗透泵。施用通过任何途径进行，包括肠胃外和经粘膜(例如，口服、经鼻、经阴道、经直肠或经皮)，特别是通过吸入。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、小动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。此外，在注射用于治疗肿瘤(例如，诱导细胞凋亡)的情况下，可以直接对肿瘤施用和/或施用至肿瘤周围的组织中。其他递送模式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉内输注、透皮贴剂等。

术语“改善”是指在病理学或病症治疗方面取得成功的任何标志，包括任何客观或主观参数，诸如减少、缓解或减轻症状或改善患者的身体或精神健康。症状的改善可基于客观或主观参数；包括身体检查和/或精神病学评估的结果。

术语“疗法”是指疾病或病症的“治疗(treating/treatment)”，包括预防可能在易患疾病但尚未经历或表现出该疾病的症状的受试者(例如，人)中发生该疾病或病症(预防性治疗)、抑制疾病(延缓或阻止其发展)、提供疾病的症状或副作用的缓解(包括姑息治疗)、以及缓解疾病(导致疾病消退)。

术语“有效量”或“有效用于……的量”或“治疗有效量”或任何语法上等同的术语是指当施用于动物或人类以治疗疾病时足以实现对该疾病的治疗的量。有效量还可以指引起细胞应答所必需的量，所述细胞应答包括例如细胞凋亡、细胞周期起始、和/或信号转导。

术语“药学上可接受的盐”包括活性化合物的盐，所述活性化合物的盐取决于本文所述的化合物上发现的具体取代基而用相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物包含相对酸性的官能性时，可以通过使此类化合物的中性形式与足够量的纯净或在合适的惰性溶剂中的所需碱接触来获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的示例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨盐或镁盐，或类似的盐。当本发明的化合物包含相对碱性的官能性时，可以通过使中性形式的此类化合物与足够量的纯净或在合适的惰性溶剂中的所需酸接触来获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的示例包括衍生自无机酸的那些酸加成盐，如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等，以及衍生自相对无毒的有机酸的盐，所述相对无毒的有机酸为例如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等。还包括氨基酸的盐，诸如精氨酸盐等，以及有机酸的盐，如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等(参见例如，Berge等人，Journal of PharmaceuticalScience,66:1-19(1977))。本发明的某些特定化合物含有碱性和酸性官能性两者，所述碱性和酸性官能性允许将化合物转化为碱加成盐或酸加成盐。

优选通过使盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物来使化合物的中性形式再生。化合物的母体形式在某些物理特性(诸如在极性溶剂中的溶解度)方面与各种盐形式不同，但在其它方面，出于本发明的目的，盐等效于化合物的母体形式。

本发明的化合物还可在构成此类化合物的原子中的一个或多个原子上包含非自然比例的原子同位素。例如，化合物可以用诸如氚(

如本文所用，“反应性官能团”是指包括但不限于以下的基团：烯烃、乙炔、醇、酚、醚、氧化物、卤化物、醛、酮、羧酸、酯、酰胺、氰酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、胺、肼、腙、酰肼、重氮、重氮鎓、硝基、腈、硫醇、硫化物、二硫化物、亚砜、砜、磺酸、亚磺酸、缩醛、缩酮、酸酐、硫酸根、次磺酸、异腈、脒、酰亚胺、亚氨酸酯、硝酮、羟胺、肟、异羟肟酸、硫代异羟肟酸、丙二烯、原酸酯、亚硫酸盐、烯胺、炔胺、脲、假脲、氨基脲、碳二亚胺、氨基甲酸酯、亚胺、叠氮化物、偶氮化合物、氧化偶氮化合物和亚硝基化合物。反应性官能团还包括用于制备生物缀合物的那些，例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺等。用于制备这些官能团中的每一种官能团的方法在本领域中是公知的，并且它们用于特定目的的应用或修改在本领域技术人员的能力范围内(参见例如，Sandler和Karo编著，Organic Functional GroupPreparations,Academic Press,San Diego,1989)。

III.

在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，变体是蛋白水解稳定的变体。在一个示例性实施方案中，与野生型相比，变体表现出增加的蛋白水解稳定性。在一些实施方案中，变体是野生型生长因子的任何变体。在一些实施方案中，变体是野生型生长因子结合的生长因子受体的拮抗剂。

在一些实施方案中，该变体是FGF1的变体。在一些实施方案中，提供了人成纤维细胞生长因子1(FGF1)的变体，所述变体包含选自氨基酸取代、氨基酸缺失、氨基酸添加以及它们的组合的至少一个成员。在一些实施方案中，提供了人成纤维细胞生长因子1(FGF1)的变体，所述变体包含选自氨基酸取代、氨基酸缺失、氨基酸添加以及它们的组合的至少一个成员，其中如与SEQ ID NO:1的野生型FGF1相比，所得FGF1变体表现出增加的蛋白水解稳定性。在一些实施方案中，所述FGF1变体在β环中或C末端附近包含氨基酸取代、氨基酸缺失、氨基酸添加以及它们的组合。在一些实施方案中，所述FGF1变体是成纤维细胞生长因子受体(FGFR)拮抗剂。本发明提供了一种FGF1多肽，所述FGF1多肽在亲本FGF1多肽(野生型，SEQID NO:1)中未发现至少一个氨基酸的至少一个位置中包括该氨基酸。

在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的FGF1变体具有至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述FGF1变体在28位、40位、47位、93位或131位处包含至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述FGF1变体包含选自由以下组成的组的至少一个氨基酸取代：D28N、Q40P、S47I、H93G、L131R、和L131K。在一些实施方案中，FGF1变体包含氨基酸取代L131R。在一些实施方案中，FGF1变体包含氨基酸取代L131K。在一些实施方案中，所述变体包含氨基酸取代D28N和L131R。在一些实施方案中，所述变体包含氨基酸取代D28N和L131K。在一些实施方案中，所述变体包含氨基酸取代Q40P、S47I、H93G和L131R。在一些实施方案中，所述变体包含氨基酸取代Q40P、S47I、H93G和L131K。在一些实施方案中，所述变体包含氨基酸取代D28N、Q40P、S47I、H93G和L131R。在一些实施方案中，所述变体包含氨基酸取代D28N、Q40P、S47I、H93G和L131K。在一些实施方案中，FGF1变体不包含氨基酸取代L131A。

在一些实施方案中，变体FGF1是被称为BS4M1(D28N和L131R)变体的变体。在一些实施方案中，BS4M1包含序列

在一些实施方案中，变体FGF1是被称为PM2(Q40P、S47I、H93G)的变体。在一些实施方案中，PM2包含序列

在一些实施方案中，变体FGF1是被称为PM3(D28N、Q40P、S47I、H93G、L131R)的变体。在一些实施方案中，PM3包含序列

在一些实施方案中，变体FGF1包含序列

在一些实施方案中，变体FGF1包含序列

在一些实施方案中，变体是分离的变体。在一些实施方案中，变体表现出本发明多肽中不存在的至少一种所需特征。示例性特征包括但不限于蛋白水解稳定性的增加、热稳定性的增加、构象柔性的增加或降低、以及拮抗活性的增加。如本领域技术人员将理解的，该变体可以表现出这些改善的特征中的两者或更多者的任意组合。

在一些实施方案中，变体FGF1是FGFR受体的拮抗剂。在一些实施方案中，FGF1变体具有选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6组成的组的序列。

在一些实施方案中，生长因子变体与亲本多肽的序列同一性为至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，本发明的生长因子变体与亲本多肽的序列同一性为至少约99.2％、至少约99.4％、至少约99.6％或至少约99.8％。

在一些实施方案中，FGF1变体与亲本多肽的序列同一性为至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，本发明的FGF1变体与亲本多肽的序列同一性为至少约99.2％、至少约99.4％、至少约99.6％或至少约99.8％。

在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的突变位置包括28、40、47、93或131中的一者或多者。如本领域技术人员将意识到的，这些位置的任何组合都可以被突变。

在一些实施方案中，如与野生型FGF1(例如，SEQ ID NO:相比，亲本多肽的在28位处的氨基酸被改变为N。

在一些实施方案中，亲本多肽的在40位处的氨基酸被改变为P。

在一些实施方案中，亲本多肽的在47位处的氨基酸被改变为I。

在一些实施方案中，亲本多肽的在93位处的氨基酸被改变为G。

在一些实施方案中，亲本多肽的在131位处的氨基酸被改变为R。在一些实施方案中，亲本多肽的在131位处的氨基酸被改变为K。

本发明提供了一种hHGF多肽，所述hHGF多肽在亲本hHGF多肽(野生型)中未发现至少一个氨基酸的至少一个位置中包括该氨基酸。本发明涵盖hHGF的所有同种型的变体，包括但不限于同种型1和3。同种型3(NCBI登录号NP_001010932)包括以下在SEQ ID NO:8(同种型1)中加下划线的五个氨基酸缺失(SFLPS)。

在一个示例性实施方案中，本发明提供了SEQ ID NO:9的具有至少一个氨基酸取代的变体。

在一个示例性实施方案中，该变体是分离的变体。此外，在各种实施方案中，变体表现出本发明多肽中不存在的至少一种所需特征。示例性特征包括但不限于对Met受体的亲和力增加、热稳定性增加、构象柔性增加或降低、以及对Met受体的激动或拮抗活性增加。如本领域技术人员将理解的，该变体可以表现出这些改善的特征中的两者或更多者的任意组合。

在一个示例性实施方案中，多肽变体是Met受体的拮抗剂。在各种实施方案中，变体是Met受体的激动剂。

在一个示例性实施方案中，本发明提供了一种hHGF多肽变体，其具有为选自SEQID NO:9的成员的序列。

示例性亲本多肽是野生型HGF同种型1(HGF NCBI登录号NP_000592)(SEQ ID NO:8)

在SEQ ID NO:8中，信号肽包含氨基酸1-31。N末端结构域包含氨基酸39-122。Kringle 1结构域包含氨基酸126-207；Kringle 2包含氨基酸208-289；Kringle 3包含氨基酸302-384；Kringle 4包含氨基酸388-470。丝氨酸蛋白酶样结构域包含495-719。

在示例性实施方案中，本发明的变体与亲本多肽的序列同一性为至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约96％、97％、98％或99％。在各种实施方案中，本发明的变体与亲本多肽的序列同一性为至少约99.2％、至少约99.4％、至少约99.6％或至少约99.8％。

在一个示例性实施方案中，SEQ ID NO:9的突变位置包括62、64、77、95、125、127、130、132、137、142、148、154、170、173和193中的一者或多者。如本领域技术人员将意识到的，这些位置的任何组合都可以被突变。在各种实施方案中，同种型3的类似位置被突变。

在一个示例性实施方案中，亲本多肽的氨基酸从K改变为选自E、N和R的成员。在一个示例性实施方案中，亲本多肽中的氨基酸从Q改变为R。在一个示例性实施方案中，亲本多肽中的氨基酸从I改变为选自T和V的成员。在一个示例性实施方案中，亲本多肽的氨基酸从N改变为D。在一些实施方案中，D可以恢复回亲本多肽的N。

在各种实施方案中，42位处的氨基酸是F或C。在各种实施方案中，62位处的氨基酸由野生型亲本多肽中发现的K改变为E。在各种实施方案中，64位处是V或A。在各种实施方案中，77位处是N或S。在各种实施方案中，95位处的氨基酸是Q或R。在各种实施方案中，125位处的氨基酸由野生型亲本多肽中发现的I改变为T。在各种实施方案中，127位处的氨基酸可以是D、N、K、R或A。在各种实施方案中，130位处的氨基酸从I改变为V。在各种实施方案中，132位处的氨基酸从K改变为N或R。在各种实施方案中，137位处的氨基酸为K或R。在各种实施方案中，154位处的氨基酸是S或A。在各种实施方案中，170位处的氨基酸是K或E。在各种实施方案中，173位处的氨基酸是Q或R。在各种实施方案中，193位处的氨基酸是N或D。在各种实施方案中，42位处的氨基酸是F或C。在各种实施方案中，96位处的氨基酸是C或R。如本领域技术人员将理解的，这些变化的任何组合以及下表中列出的那些的任何组合可以存在于本发明的多肽变体中。

在一些实施方案中，与野生型HGF(SEQ ID NO:9)相比，HGF变体包含K62E、N127D、K170E和N193E。在一些实施方案中，与野生型HGF(SEQ ID NO:9)相比，HGF变体包含K62E、Q95R、N127D、K132N、K170E、Q173R和N193E。

在一些实施方案中，与野生型HGF(SEQ ID NO:9)相比，HGF变体包含在所列位置处具有以下特定氨基酸的共有序列：K62E、Q95R、I125T、N127D、I130V、K132N、K137R、K170E、Q173R、和N193E。

表1、表2和表3显示了本发明的示例性突变。

表1.

表2.从第三轮定向进化分离出的NK1突变体的各个序列突变。SEQ ID NO:1是野生型；与野生型序列的唯一差异在SEQ ID NO:9中示出；空白区表示保留了野生型hHGF残基。

bp：碱基对突变的数量

AA：氨基酸突变的数量

表3.从第三轮定向进化分离出的NK1突变体的各个序列突变。SEQ ID NO:9是野生型；与野生型序列的唯一差异在SEQ ID NO:9中示出。

bp：碱基对突变的数量

AA：氨基酸突变的数量

a.

本发明提供了本发明的变体与一种或多种缀合配偶体的缀合物。示例性的缀合配偶体包括聚合物、靶向剂、治疗剂、细胞毒性剂、螯合剂和可检测剂。本领域技术人员将认识到，这些非限制性剂类别之间存在重叠。

缀合配偶体或“修饰基团”可以是任何可缀合的部分。示例性的修饰基团在下面讨论。可以根据修饰基团改变给定多肽的特性(例如，生物学或物理化学特性)的能力来选择修饰基团。可以通过使用修饰基团来改变的示例性多肽特性包括但不限于药代动力学、药效动力学、代谢稳定性、生物分布、水溶性、亲脂性、组织靶向能力和治疗活性谱。修饰基团可用于修饰在诊断应用或体外生物测定系统中使用的多肽。

在一些实施方案中，包括例如如本文所述的FGF1变体的生长因子变体与Fc部分组合。Fc部分可来源于人或动物免疫球蛋白(Ig)，所述Ig优选为IgG。IgG可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(参见，例如图34)。还优选的是，Fc部分来源于免疫球蛋白，优选IgG的重链。更优选地，该Fc部分包含免疫球蛋白重链恒定区的一部分，诸如，结构域。该Ig恒定区优选包含选自铰链、CH2、CH3结构域中的任何一个或它们的任何组合的至少一个Ig恒定结构域。在一些实施方案中，Fc部分包含至少CH2和CH3结构域。进一步优选的是，Fc部分包含IgG铰链区、CH2和CH3结构域。

表4：示例性IgG序列：

IgG1亚类的Fc结构域通常用作Fc部分，因为IgG1具有任何血清蛋白中最长的血清半衰期。漫长的血清半衰期可能是动物研究和潜在的人类治疗用途所需的蛋白质特征。另外，IgG1亚类具有最强的进行抗体介导的效应子功能的能力。

在融合蛋白中最有用的主要效应子功能是IgG1抗体介导抗体依赖性细胞毒性的能力。另一方面，对于主要起拮抗剂作用的融合蛋白，这可能是非期望的功能。已经确定了几个对IgG1亚类中抗体恒定区介导的活性重要的特定氨基酸残基。因此，包含或排除这些特定氨基酸允许包含或排除特定免疫球蛋白恒定区介导的活性。

根据本发明，还可以修饰Fc部分以调节效应子功能。例如，如果Fc部分来源于IgG1，则根据EU索引位置(Kabat等人，1991)可以引入以下Fc突变：T250Q/M428L；M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F；E233P/L234V/L235A/AΔ236+A327G/A330S/P331S；E333A；K322A。

进一步的Fc突变可以是例如在选自330、331、234或235或它们的组合的EU索引位置处的取代。在本发明的上下文中，也可以将位于CH2结构域中的EU索引位置297处的氨基酸取代引入Fc部分，从而消除潜在的N连接的碳水化合物附接位点。EU索引位置220处的半胱氨酸残基也可以被替换。

本发明的Fc融合蛋白可以是单体或二聚体。Fc融合蛋白也可以是“伪二聚体”，其含有二聚Fc部分(例如，两个二硫键桥接的铰链-CH2-CH3构建体的二聚体)，所述二聚Fc部分中的仅一个Fc部分与治疗部分融合。

Fc融合蛋白可以是含有两个不同治疗部分的异二聚体，或是含有单个治疗部分的两个拷贝的同二聚体。

在一些实施方案中，本文所述的生长因子变体(包括例如FGF1变体)的体内半衰期可以用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)部分延长。用PEG对多肽进行化学修饰(聚乙二醇化)会增加多肽的分子大小并通常会降低表面和官能团的可及性，所述表面和官能团的可及性中的每一者取决于附接至多肽的PEG部分的数量和大小。通常，这种修饰导致血浆半衰期和蛋白水解稳定性的改善，以及免疫原性和肝摄取的降低(Chaffee等人，J.Clin.Invest.89:1643-1651(1992)；Pyatak等人，Res.Commun.Chem.PatholPharmacol.29:113-127(1980))。例如，据报道白介素2的聚乙二醇化增加了其体内抗肿瘤效力(Katre等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84:1487-1491(1987))，并且来源于单克隆抗体A7的F(ab’)2的聚乙二醇化改善了其肿瘤定位(Kitamura等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.28:1387-1394(1990))。因此，在另一个实施方案中，通过本发明的方法用PEG部分衍生化的多肽的体内半衰期相对于非衍生化的亲本多肽的体内半衰期增加。

多肽的体内半衰期的增加最好表示为相对于亲本多肽的增加百分比范围。所述增加百分比范围的下限为约40％、约60％、约80％、约100％、约150％或约200％。所述范围的上限为约60％、约80％、约100％、约150％、或大于约250％。

许多水溶性聚合物是本领域技术人员已知的，并且可用于实践本发明。术语水溶性聚合物涵盖诸如以下的物质：糖(例如，葡聚糖、直链淀粉、透明质酸、聚(唾液酸)、类肝素、肝素等)；聚(氨基酸)，例如聚(天冬氨酸)和聚(谷氨酸)；核酸；合成聚合物(例如，聚(丙烯酸)、聚(醚)，例如聚(乙二醇)；肽、蛋白质等。本发明可以用任何水溶性聚合物实践，唯一的限制是该聚合物必须包含可以附接其余缀合物的点。参见例如，Harris,Macronol.Chem.Phys.C25:325-373(1985)；Scouten,Methods in Enzymology 135:30-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14:866-874(1992)；Delgado等人，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249-304(1992)；Zalipsky,Bioconjugate Chem.6:150-165(1995)；和Bhadra等人，Pharmazie,57:5-29(2002)。

在另一个实施方案中，类似于以上讨论的那些，经修饰的糖包括水不溶性聚合物，而不是水溶性聚合物。本发明的缀合物还可以包括一种或多种水不溶性聚合物。通过使用缀合物作为媒介物来说明本发明的该实施方案，使用该媒介物以受控方式递送治疗性多肽。聚合物药物递送系统是本领域中已知的。参见例如，Dunn等人编著，Polymeric DrugsAnd Drug Delivery Systems,ACS Symposium Series，第469卷,American ChemicalSociety,Washington,D.C.1991。本领域技术人员将理解，基本上任何已知的药物递送系统均适用于本发明的缀合物。

代表性的水不溶性聚合物包括但不限于聚膦嗪、聚(乙烯醇)、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚丙烯酰胺、聚亚烷基二醇、聚亚烷基氧化物、聚对苯二甲酸亚烷基酯、聚乙烯基醚、聚乙烯基酯、聚乙烯基卤化物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、普朗尼克(pluronics)和聚乙烯基苯酚以及它们的共聚物。

用于本发明的缀合物的代表性生物可降解聚合物包括但不限于聚丙交酯、聚乙交酯以及它们的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共聚-己内酯)、聚(丙交酯-共聚-乙交酯)、聚酸酐、聚原酸酯，它们的共混物和共聚物。形成凝胶的组合物是特别有用的，诸如包括胶原蛋白、普朗尼克等的那些。

示例性可吸收聚合物包括例如合成生产的聚(α-羟基-羧酸)/聚(氧乙烯)的可吸收嵌段共聚物(参见，Cohn等人，美国专利第4,826,945号)。这些共聚物没有交联并且是水溶性的，使得身体可以排泄降解的嵌段共聚物组合物。参见，Younes等人，JBiomed.Mater.Res.21:1301-1316(1987)；和Cohn等人，J Biomed.Mater.Res.22:993-1009(1988)。

作为水凝胶的组分的聚合物也可用于本发明。水凝胶是能够吸收相对大量水的聚合材料。形成水凝胶的化合物的示例包括但不限于聚丙烯酸、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷、明胶、角叉菜胶和其他多糖、羟乙烯甲基丙烯酸(hydroxyethylenemethacrylic acid，HEMA)，以及它们的衍生物等。可以生产稳定、生物可降解和生物可吸收的水凝胶。此外，水凝胶组合物可包含表现出这些特性中的一种或多种特性的亚基。

在另一个实施方案中，该凝胶是热可逆凝胶。目前优选的是包含诸如以下组分的热可逆凝胶：普朗尼克、胶原蛋白、明胶、透明质酸、多糖、聚氨酯水凝胶、聚氨酯-脲水凝胶以及它们的组合。

在另一个示例性实施方案中，本发明的缀合物包含脂质体的组分。脂质体可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如如在1985年6月11日发布的Eppstein等人的美国专利第4,522,811号中所述。例如，脂质体制剂可通过以下方式制备：将适当的脂质(例如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰胆碱、花生四烯酰磷脂酰胆碱和胆固醇)溶解在无机溶剂中，然后将所述无机溶剂蒸发掉，留下干脂质薄膜在容器的表面上。然后将活性化合物或其药学上可接受的盐的水溶液引入容器中。然后用手旋动容器以从容器的侧面释放脂质材料并分散脂质聚集体，从而形成脂质体悬浮液。

本发明还提供了类似于上述缀合物的缀合物，其中将多肽缀合至治疗部分、诊断部分、靶向部分、毒素部分等。上述部分中的每个可以是小分子、天然聚合物(例如，多肽)或合成聚合物。

在各种实施方案中，变体缀合至基质的组分以用于组织再生。示例性基质在本领域中是已知的，并且其在本领域技术人员用本发明的生长因子变体，包括例如FGF1变体选择和修饰合适基质的能力范围内。本发明的生长因子变体，包括例如FGF1变体，通常用于再生医学应用，包括例如眼、肝、肌肉、神经和心脏组织的再生。

在一些实施方案中，本发明提供了由于作为缀合物的组分的靶向剂的存在而选择性地定位在特定组织中的缀合物。在示例性实施方案中，靶向剂是蛋白质。示例性蛋白质包括转铁蛋白(脑、血池)、HS糖蛋白(骨、脑、血池)、抗体(脑、具有抗体特异性抗原的组织、血池)、凝血因子V-XII(受损的组织、凝块、癌症、血池)、血清蛋白(例如，α-酸性糖蛋白、胎球蛋白、α-胎儿蛋白(脑、血池)、β2-糖蛋白(肝、动脉粥样硬化斑块、脑、血池))、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、和EPO(免疫刺激、癌症、血池、红血球过度生产、神经保护)、白蛋白(半衰期延长)、IL-2和IFN-α。

在另一实施方案中，本发明提供了本发明的生长因子变体(包括例如FGF1变体)与治疗部分之间的缀合物。可用于实践本发明的治疗部分包括来自具有多种药理活性的多种药物类别的药物。将治疗剂和诊断剂缀合到各种其他物质的方法是本领域技术人员众所周知的。参见例如，Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego,1996；和Dunn等人编著，Polymeric Drugs And Drug Delivery Systems,ACS SymposiumSeries，第469卷，American Chemical Society,Washington,D.C.1991。

有用的治疗部分的类别包括例如抗肿瘤药(例如，抗雄激素(例如，亮丙瑞林或氟他胺)、杀细胞剂(例如，阿霉素、多柔比星、紫杉醇、环磷酰胺、白消安、顺铂、β-2-干扰素)、抗雌激素(例如，它莫西芬)、抗代谢物(例如，氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤)。在该类别中还包括用于诊断和疗法两者的基于放射性同位素的剂，以及缀合的毒素，诸如蓖麻毒素、格尔德霉素、美登素、CC-1065、倍癌霉素、卡奇霉素(Chlicheamycin)以及它们的相关结构和类似物。

治疗部分也可以是激素(例如，甲羟孕酮、雌二醇、亮丙瑞林、甲地孕酮、奥曲肽或生长抑素)；内分泌调节药物(例如，避孕药(例如，炔诺醇、乙炔雌二醇、炔诺酮、美雌醇、去氧孕烯、甲羟孕酮))。在本发明的各种实施方案中使用的是与雌激素(例如，二乙基己烯雌酚)、糖皮质激素(例如，去炎松、倍他米松等)和黄体酮(诸如炔诺酮、炔诺醇、炔诺酮、左炔诺黄体酮)的缀合物；甲状腺剂(例如，碘塞罗宁或左旋甲状腺素)或抗甲状腺剂(例如，甲巯咪唑)；抗高催乳素血症药(例如，卡麦角林)的缀合物；也可以使用激素抑制剂(例如，达那唑或戈舍瑞林)、催产药(例如，甲基麦角新碱或催产素)和前列腺素，例如米索前列醇、前列地尔或地诺前列酮。

其他有用的修饰基团包含免疫调节药物(例如，抗组胺药、肥大细胞稳定剂，例如洛度沙胺和/或色甘酸)、类固醇(例如，去炎松、倍氯米松(beclomethazone)、可的松、地塞米松、泼尼松龙、甲基强的松龙、倍氯米松(beclomethasone)或氯倍他索)、组胺H2拮抗剂(例如，法莫替丁、西咪替丁、雷尼替丁)、免疫抑制剂(例如，硫唑嘌呤、环孢菌素)等。也可以使用具有抗炎活性的基团，例如舒林酸、依托度酸、酮洛芬和酮咯酸。与本发明结合使用的其他药物对于本领域技术人员将是显而易见的。

在一些实施方案中，通过反应性氨基酸与所述反应性氨基酸的反应性缀合配偶体之间的反应形成缀合物。反应性氨基酸和反应性缀合配偶体都在它们的构架内包括一个或多个反应性官能团。所述两种结合物质中的一种结合物质可包括“离去基团”(或活化基团)，所述基团是指那些在酶调节的亲核取代反应中容易替代，或者在利用亲核反应配偶体的化学反应中被替代的部分(例如，带有巯基的氨基酸部分)。为每种类型的反应选择合适的离去基团在技术人员的能力范围内。许多活化的糖是本领域中已知的。参见例如，Vocadlo等人，Carbohydrate Chemistry and Biology，第2卷，Ernst等人编著，Wiley-VCHVerlag:Weinheim,Germany,2000；Kodama等人，Tetrahedron Lett.34:6419(1993)；Lougheed等人，J.Biol.Chem.274:37717(1999))。

在各种实施方案中，氨基酸取代是天然存在的FGF1的变体(the variant或avariant)，是用于附接缀合配偶体(例如，侧链氨基酸，例如半胱氨酸、赖氨酸、丝氨酸等)的位点。

在实践本发明中有用的反应性基团和反应类别通常是生物缀合物化学领域中众所周知的那些。目前可用的与反应性糖部分的有利反应类别是那些在相对温和的条件下进行的反应。这些包括但不限于亲核取代(例如，胺和醇与酰基卤、活性酯的反应)、亲电子取代(例如，烯胺反应)以及至碳-碳和碳-杂原子多键的加成(例如，Michael反应、Diels-Alder加成)。这些和其他有用的反应在例如March,Advanced Organic Chemistry,第3版，John Wiley&Sons,New York,1985；Hermanson,Bioconjugate Techniques,AcademicPress,San Diego,1996；和Feeney等人,Modification of Proteins；Advances inChemistry Series,第198卷,American Chemical Society,Washington,D.C.,1982中进行了讨论。

b.

反应性氨基酸或反应性缀合配偶体上有用的反应性官能团包括但不限于：

(a)羧基及其各种衍生物，包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰基卤、酰基咪唑、硫代酯、对硝基苯基酯、烷基、烯基、炔基和芳族酯；

(b)羟基，其可转化为例如酯、醚、醛等；

(c)卤代烷基，其中卤基可随后被亲核基团替代，所述亲核基团为诸如胺、羧酸根阴离子、硫醇根阴离子、碳负离子或醇盐离子，从而导致新基团共价附接在卤素原子的官能团处；

(d)亲双烯体基团，其能够参与Diels-Alder反应，为诸如马来酰亚胺基；

(e)醛基或酮基，使得可以通过形成羰基衍生物，例如亚胺、腙、半卡巴腙或肟，或通过诸如格氏加成或烷基锂加成的机理进行随后的衍生化；

(f)磺酰卤化物基团，其用于随后与胺反应，例如以形成磺酰胺；

(g)硫醇基团，其可以例如转化为二硫化物或与酰基卤反应；

(h)胺基或巯基，其可以例如经酰化、烷基化或氧化；

(i)烯烃，其可以经历例如环加成、酰化、Michael加成等；和

(j)环氧化物，其可以与例如胺和羟基化合物反应。

反应性官能团可以经选择为使得它们不参与或干扰装配反应性糖核或修饰基团所必需的反应。或者，可以通过保护基团的存在来保护反应性官能团不参与反应。本领域技术人员理解如何保护特定的官能团，以使其不干扰选定的一组反应条件。对于有用的保护基团的示例，参见例如，Greene等人，Protective Groups in Organic Synthesis,JohnWiley&Sons,New York,1991。

连接多肽和缀合配偶体的基团也可以是交联基团，例如零阶或更高阶的交联基团(关于交联试剂和交联工序的综述，参见：Wold,F.,Meth.Enzymol.25:623-651,1972；Weetall,H.H.和Cooney,D.A.，Enzymes as Drugs.(Holcenberg和Roberts编著)第395-442页，Wiley,New York,1981；Ji,T.H.,Meth.Enzymol.91:580-609,1983；Mattson等人，Mol.Biol.Rep.17:167-183,1993，所有这些文献都以引用方式并入本文)。优选的交联试剂衍生自各种零长度、同双官能和异双官能的交联试剂。零长度交联试剂包含两个内在化学基团的直接缀合，而没有引入外部材料。催化二硫键形成的剂属于这一类别。另一个示例是诱导羧基和伯氨基缩合以形成酰胺键的试剂，例如碳二亚胺、氯甲酸乙酯、伍德沃德氏试剂K(Woodward’s reagent K)(2-乙基-5-苯基异噁唑鎓-3'-磺酸盐)和羰基二咪唑。除这些化学试剂外，还可以使用转谷氨酰胺酶(谷氨酰基-肽γ-谷氨酰胺转移酶；EC 2.3.2.13)作为零长度交联试剂。该酶催化与蛋白质结合的谷氨酰胺残基的羧酰胺基团处的酰基转移反应，通常以伯氨基为底物。优选的同双官能和异双官能试剂分别包含两个相同或两个不同的位点，所述位点可对于氨基、巯基、胍基、吲哚或非特异性基团是反应性的。

附接至本发明的多肽的示例性缀合配偶体包括但不限于PEG衍生物(例如，烷基-PEG、酰基-PEG、酰基-烷基-PEG、烷基-酰基-PEG、氨基甲酰基-PEG、芳基-PEG)、PPG衍生物(例如，烷基-PPG、酰基-PPG、酰基-烷基-PPG、烷基-酰基-PPG、氨基甲酰基-PPG、芳基-PPG)、治疗部分、诊断部分、6-磷酸甘露糖、肝素、类肝素、Sle

除共价附接外，本发明的生长因子变体，包括例如FGF1变体，可通过非共价相互作用而附接至生物材料的表面上。非共价蛋白掺入可以例如通过包封或吸收来完成。本发明的多肽至生物材料的附接可以通过肝素介导。在一些实施方案中，本发明的多肽附接至肝素-海藻酸盐聚合物和海藻酸盐，如在Harada等人，J.Clin.Invest.(1994)94:623-630；Laham等人，Circulation(1999)1865-1871和其中引用的参考文献中所述。在其他实施方案中，本发明的多肽附接至基于胶原蛋白的生物材料。

c.

本发明的示例性缀合物是包含本发明的变体和可检测部分的显像剂，该可检测部分是在成像模态下可检测的。迫切需要分子成像探针，该分子成像探针将特异性靶向活体受试者中的Met受体，并允许对肿瘤进行非侵入性表征以供用于患者特定的癌症治疗和疾病管理。通过非侵入性成像检测表达Met的肿瘤的能力也可以作为转移风险的指标。

本发明的缀合物可用于的示例性成像模态包括但不限于正电子放射断层造影术(positron emission tomography，PET)，其中本发明的变体被正电子放射同位素标记。典型的同位素包括

在一个示例性实施方案中，缀合配偶体通过在选定条件下切割的键连接至本发明的多肽变体。示例性条件包括但不限于选定的pH(例如，胃、肠、细胞内噬液泡)、活性酶(例如，酯酶、还原酶、氧化酶)的存在、光、热等。许多可切割基团是本领域中已知的。参见例如，Jung等人，Biochem.Biophys.Acta,761:152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol.Chem.,265:14518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.,124:913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.,155:141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.,261:205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.,143:1859-1867(1989)。

IV.

本发明的生长因子变体，包括例如FGF1变体及其缀合物，具有广泛的药物应用。

因此，在另一方面中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种本发明的多肽或多肽缀合物，以及药学上可接受的稀释剂、载体、媒介物、添加剂或它们的组合。本发明的药物组合物适用于多种药物递送系统。用于本发明的合适制剂在Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mace Publishing Company,Philadelphia,PA，第17版(1985)中存在。对于用于药物递送的方法的简要综述，参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)。

可以将药物组合物配制成用于任何合适的施用方式，包括例如局部、口服、经鼻、静脉内、颅内、腹膜内、皮下或肌内施用。对于肠胃外施用，诸如皮下注射，载体优选包括水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲剂。对于口服施用，可以采用上述载体中的任一者或固体载体，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。生物可降解的基质，诸如微球(例如，聚乳酸酯聚乙醇酸酯)，也可用作用于本发明药物组合物的载体。合适的生物可降解的微球公开于例如美国专利第4,897,268号和第5,075,109号中。

通常，药物组合物皮下地或肠胃外地(例如，静脉内地)施用。因此，本发明提供了用于肠胃外施用的组合物，所述组合物包含溶解或悬浮在可接受的载体中的化合物，所述载体优选为水性载体，例如水、缓冲水、盐水、PBS等。所述组合物还可包含洗涤剂，诸如吐温20和吐温80；稳定剂，诸如甘露醇、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖；以及防腐剂，诸如EDTA和间甲酚。所述组合物可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、洗涤剂等。

这些组合物可以通过常规的灭菌技术进行灭菌，或者可以进行无菌过滤。所得水溶液可按原样或以冻干形式进行包装，将冻干制备物在施用之前与无菌水性载体配混。制备物的pH通常将介于3与11之间，更优选从5至9，最优选从7至8。

在一些实施方案中，可以将本发明的糖肽掺入由标准囊泡形成脂质形成的脂质体中。有多种方法可用于制备脂质体，如在例如，Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)，美国专利第4,235,871号、第4,501,728号和第4,837,028号中所述。使用多种靶向剂(例如，本发明的唾液酸化半乳糖苷)实现脂质体靶向是本领域中众所周知的(参见例如，美国专利第4,957,773号和第4,603,044号)。

可以使用用于将靶向剂偶联至脂质体的标准方法。这些方法通常涉及将以下物质掺入脂质体中：脂质组分(例如磷脂酰乙醇胺)，其可以被活化以附接靶向剂，或衍生的亲脂性化合物(例如本发明的脂质衍生的糖肽)。

靶向机制通常需要将靶向剂以这样的方式放置在脂质体的表面上，使得靶部分可用于与靶，例如细胞表面受体相互作用。在使用本领域技术人员已知的方法形成脂质体之前，可以使本发明的碳水化合物附接至脂质分子(例如，将碳水化合物上存在的羟基分别用长链烷基卤化物或用脂肪酸进行烷基化或酰化)。

或者，脂质体可以这样的方式使用，使得在形成膜时首先将连接物部分结合到膜中。连接物部分必须具有亲脂性部分，所述亲脂性部分必须牢固地嵌入并锚定在膜中。它还必须具有反应性部分，所述反应性部分是在脂质体的水性表面上化学可得的。反应性部分经选择为使得其在化学上适合与稍后加入的靶向剂或碳水化合物形成稳定的化学键。在一些实施方案中，可以将靶剂直接附接到连接物分子，但是在大多数情况下，更合适的是使用第三分子充当化学桥，从而将膜中的连接物分子与从囊泡表面三维延伸的靶剂或碳水化合物连接。

通过本发明的方法制备的生长因子变体，包括例如FGF1变体，也可以用作诊断试剂。例如，经标记的化合物可用于在怀疑患有炎症的患者中定位炎症或肿瘤转移的区域。为此用途，可以用

V.

在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据上文阐述的实施方案中的任何实施方案的生长因子变体，包括例如FGF1变体。在一些实施方案中，本发明提供了与该核酸互补的核酸。

在一些实施方案中，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包含与启动子可操作地连接的核酸，所述核酸编码根据上文阐述的实施方案中的任何实施方案的多肽变体。

VI.

在各种实施方案中还提供了生长因子变异多肽的文库，所述生长因子变异多肽包括例如FGF1变异多肽，所述文库包括多个不同成员，其中所述文库的每个成员对应于共用的亲本生长因子多肽或FGF1亲本多肽并且其中文库的每个成员在亲本多肽中不存在某一氨基酸的位置处包含该氨基酸。

a.

为了产生FGF1或其它生长因子的随机化文库，制备寡核苷酸，所述寡核苷酸编码各种FGF1或其它生长因子的序列。合成地或通过标准重组技术制备用于在酵母中表达生长因子变异多肽(包括例如FGF1变异多肽)的DNA。在要改变氨基酸的情况下，针对给定位置合成了二十个不同的密码子，每个密码子编码不同的氨基酸。已经使用随机化的寡核苷酸合成来创建其中约5至约15个氨基酸是随机化的编码盒(参见例如，Burritt等人，(1996)Anal.Biochem.238:1 13；Lowman(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26:410 24；Wilson(1998)Can.J.Microbiol.44:313 329)。

通常用于改良突变体的进化的酵母展示载体被称为“pCT”。该载体在于2004年7月29日公布的标题为“Yeast cell surface display of proteins and uses thereof(蛋白质的酵母细胞表面展示及其用途)”的Wittrup等人的US 2004/0146976进一步描述。如此处所述，载体提供了感兴趣的多肽的N末端与酵母Aga2p细胞壁蛋白的C末端的遗传融合。每个酵母细胞的外壁可展示约10

在本发明的一些实施方案中，通常用于工程化高亲和力结合物的酵母展示平台也被用于工程化具有更大蛋白水解稳定性的蛋白质(参见例如，图1)。在一些实施方案中，将单个生长因子变体的数千拷贝作为系留的融合体展示在酵母表面上。在一些实施方案中，血凝素(HA)标签在生长因子的上游表达，而c-myc标签在生长因子的下游表达。在一些实施方案中，细胞可以与对应受体的可溶性Fc融合体一起孵育，所述可溶性Fc融合体可以与酵母展示的生长因子结合。

在一些实施方案中，将酵母展示平台与流式活化细胞分选(FACS)组合以工程化具有更高蛋白水解稳定性的生长因子(参见例如，图2)。在一些实施方案中，可以通过随机诱变、定向诱变、或DNA改组、或如上所述或本领域中已知的其他重组技术来产生生长因子突变体的文库。在一些实施方案中，将酵母细胞文库与感兴趣的蛋白酶一起孵育，在此期间发生酵母表面展示的蛋白质的切割。在一些实施方案中，具有更大蛋白水解稳定性的生长因子突变体对酵母细胞表面上的切割更具抗性。在一些实施方案中，在蛋白酶孵育之后，将细胞洗涤并与功能性受体的可溶性Fc融合体一起孵育，所述可溶性Fc融合体与具有保留的受体结合亲和力的正确折叠的生长因子突变体结合。在一些实施方案中，FACS用于分选正确折叠的、未切割的生长因子突变体，将经分选的生长因子突变体扩增并诱导以进行下一轮分选。

在一些实施方案中，针对Fc结构域、c-myc结构域和HA标签的荧光抗体标记物用于测量受体结合、生长因子特异性切割和非特异性切割(参见例如，下表2)。在一些实施方案中，对结合的Fc融合受体的检测允许确认生长因子的突变不会严重降低对该受体的结合亲和力或导致不正确的蛋白质折叠。在一些实施方案中，生长因子特异性切割是生长因子的蛋白水解稳定性的直接度量。在一些实施方案中，通过c-myc信号检测生长因子特异性切割，因为经切割的生长因子的C末端c-myc标签将被去除。在一些实施方案中，当蛋白酶在酵母表面展示蛋白(例如酵母展示蛋白Aga1p和Aga2p)内切割时，发生非特异性切割。在一些实施方案中，在非特异性切割期间，所有三种标记物的荧光信号均降低。在一些实施方案中，这是非期望的，因为用于检测生长因子切割和结合活性的动态范围降低了。在一些实施方案中，HA信号用于确保由感兴趣的蛋白酶进行的非特异性切割是最小的。

表5：不同事件对从荧光抗体标记物观察到的信号的影响。

在一些实施方案中，可以将野生型生长因子及其变体克隆到pCT载体中。在一些实施方案中，野生型生长因子及其变体可以作为与Aga2p接合蛋白(mating protein)的融合体而在酿酒酵母(S.cerevisiae)酵母细胞的表面上表达。在一些实施方案中，野生型生长因子及其变体在酵母细胞表面上的成功表达可以通过检测蛋白质的C末端上的c-myc标签来确认。在一些实施方案中，经酵母展示的野生型生长因子及其变体的正确折叠可以通过测量对野生型生长因子-Fc的特异性结合活性来确认。

在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的FGF1多肽用作模型来说明蛋白水解稳定性筛选的设置。在一些实施方案中，将野生型FGF1克隆到pCT载体中。在一些实施方案中，该FGF1多肽及其FGF1变体可以作为与Aga2p接合蛋白的融合体在酿酒酵母酵母细胞的表面上表达(参见例如，图3A)。在一些实施方案中，FGF1在酵母细胞表面上的成功表达可以通过检测蛋白质的C末端上的c-myc标签来确认(参见例如，图3B)。在一些实施方案中，酵母展示的FGF的正确折叠可以通过测量对FGFR1-Fc的特异性结合活性来确认(参见例如，图3C)。

在一些实施方案中，血清、胰蛋白酶、糜蛋白酶和纤溶酶可用于开发对生长因子变异多肽(包括例如，FGF1变异多肽)的蛋白水解稳定性筛选。在一些实施方案中，这些蛋白酶是基于它们与生长因子变异多肽，包括例如FGF1变异多肽的科学和生物学相关性来选择的。在一些实施方案中，蛋白酶对筛选的适合性是通过其以对酵母展示蛋白的最小非特异性切割、以合理的速率切割生长因子的能力来确定的。在一些实施方案中，血清可用于开发生长因子变异多肽，包括例如FGF1变异多肽的蛋白水解稳定性筛选。在一些实施方案中，胰蛋白酶可用于开发生长因子变异多肽，包括例如FGF1变异多肽的蛋白水解稳定性筛选。在一些实施方案中，糜蛋白酶可用于开发生长因子变异多肽，包括例如FGF1变异多肽的蛋白水解稳定性筛选。在一些实施方案中，纤溶酶可用于开发生长因子变异多肽，包括例如FGF1变异多肽的蛋白水解稳定性筛选。

在一些实施方案中，通过比较野生型生长因子的蛋白水解切割与变异生长因子的蛋白水解切割来确定稳定性。在一些实施方案中，通过比较野生型FGF1的蛋白水解切割与FGF1变体的蛋白水解切割来确定稳定性。

在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少5％到至少95％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少10％到至少90％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少5％到至少90％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少5％到至少85％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少5％到至少80％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少5％到至少75％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少5％到至少70％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少10％到至少70％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少5％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少10％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少15％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少20％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少25％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少30％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少35％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少40％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少45％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少50％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少5％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少60％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少65％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少70％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少75％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少80％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少85％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少90％。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少95％。

在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少5％到至少95％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少10％到至少90％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少5％到至少90％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少5％到至少85％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少5％到至少80％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少5％到至少75％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少5％到至少70％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少10％到至少70％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少5％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少10％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少15％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少20％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少25％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少30％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少35％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少40％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少45％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少50％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少5％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少60％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少65％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少70％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少75％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少80％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少85％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少90％。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少95％。

在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少1倍到至少10倍。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少1倍。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少2倍。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少3倍。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少4倍。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少5倍。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少6倍。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少7倍。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少8倍。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少9倍。在一些实施方案中，与野生型生长因子相比，生长因子变体的稳定性提高了至少10倍。

在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少1倍到至少10倍。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少1倍。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少2倍。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少3倍。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少4倍。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少5倍。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少6倍。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少7倍。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少8倍。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少9倍。在一些实施方案中，与野生型FGF1相比，FGF1变体的稳定性提高了至少10倍。

b.

在一些实施方案中，筛选可包括使用细胞分选仪。商购可得的流式细胞仪可以每秒大约50,000个细胞的速率测量四个或更多个波长下的单细胞水平的荧光发射(Ashcroft和Lopez，2000)。可以显示典型的流式细胞术数据，其中已用两种不同颜色的荧光探针标记酵母以测量蛋白质表达水平和结合的可溶性配体(例如，生长因子受体)。由于每个细胞基础上蛋白质表达水平的变化，导致出现“对角线”细胞群：表达更多蛋白质的细胞将结合更多配体。平衡结合常数(K

可以在FACS Vantage(BD Biosciences)多参数激光流式细胞仪和细胞分选仪上进行细胞分选。在分选之前，如上所述进行荧光染色，从而如上所述检测各种多肽水平的分析。

VII.

a.

可以使用常规的逐步溶液或固相合成来制备本发明的多肽变体(参见例如，Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins,Williams等人编著，1997,CRC Press,Boca Raton Florida，以及其中引用的参考文献；Solid PhasePeptide Synthesis:A Practical Approach,Atherton和Sheppard编著，1989,IRL Press,Oxford,England，以及其中引用的参考文献)。

或者，本发明的肽可以通过区段缩合来制备，如例如在Liu等人，1996,Tetrahedron Lett.37(7)933 936；Baca等人，1995,J.Am.Chem.Soc.117:1881-1887；Tam等人，1995,Int.J.Peptide Protein Res.45:209-216；

含有N末端和/或C末端封端基团的多肽变体可以使用标准有机化学技术制备。例如，用于酰化肽的N末端或酰胺化或酯化肽的C末端的方法是本领域中众所周知的。用于进行N末端和/或C末端处的其他修饰的模式对本领域技术人员而言将是显而易见的，如保护任何侧链官能团的模式对于附接末端封端基团可能是必需的。药学上可接受的盐(抗衡离子)可以通过离子交换色谱法或本领域众所周知的其他方法方便地制备。

串联多聚体形式的本发明化合物可通过在合成的适当步骤处将接头添加至肽链而方便地合成。或者，可以合成螺旋区段，并且每个区段与接头反应。当然，实际的合成方法将取决于接头的组成。合适的保护方案和化学方法是众所周知的，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

可以使用三聚和四聚树脂和化学方法方便地合成呈支化网络形式的本发明化合物，所述化学方法描述于Tam,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5409-5413和Demoor等人，1996,Eur.J.Biochem.239:74-84中。修饰合成树脂和用于合成更高阶或更低阶的支化网络的策略，或所述支化网络包含不同核心肽螺旋区段的组合，完全在肽化学和/或有机化学领域技术人员的能力范围内。如果需要的话，通常在温和的氧化剂存在下进行二硫键的形成。

可以使用化学氧化剂，或者可以将化合物简单地暴露于大气氧中以实现这些键。各种方法在本领域中是已知的，包括例如由Tam等人，1979,Synthesis 955-957；Stewart等人，1984,Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chemical Company Rockford,IL；Ahmed等人，1975,J.Biol.Chem.250:8477-8482；和Pennington等人，1991Peptides1990 164-166,Giralt和Andreu编著，ESCOM Leiden,The Netherlands所描述的那些方法。附加替代方案由Kamber等人，1980,Helv.Chim.Acta 63:899-915描述。在固体载体上进行的方法由Albericio,1985,Int.J.Peptide Protein Res.26:92-97描述。这些方法中的任何一种方法均可用于在本发明的肽中形成二硫键。

VIII.

a.

掺入本发明的O-连接的糖基化序列的变异和/或突变多肽的创建可以通过突变或通过多肽的完全化学合成，改变相应亲本多肽的氨基酸序列来实现。多肽氨基酸序列优选通过DNA水平的变化而改变，特别是通过使预选的碱基处编码多肽的DNA序列突变以产生密码子，所述密码子将翻译成所需氨基酸。DNA突变优选使用本领域已知的方法进行。

本发明依赖于重组遗传学领域中的常规技术。公开用于本发明的一般方法的基本文献包括Sambrook和Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版，2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；和Ausubel等人编著，Current Protocols in Molecular Biology(1994)。

核酸大小以千碱基(kb)或碱基对(bp)为单位给出。这些是来源于琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、来源于经测序的核酸、或来源于公开的DNA序列的估计值。对于蛋白质，大小是以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数给出的。蛋白质大小是根据凝胶电泳、根据经测序的蛋白质、根据衍生的氨基酸序列、或根据公开的蛋白质序列估计的。

可以例如根据由Beaucage和Caruthers,Tetrahedron Lett.22:1859-1862(1981)首次描述的固相亚磷酰胺三酯方法，使用自动合成仪来化学合成无法商购获得的寡核苷酸，如在Van Devanter等人，Nucleic Acids Res.12:6159-6168(1984)中所述。整个基因也可以化学合成。寡核苷酸的纯化是使用任何本领域公认的策略执行的，所述任何本领域公认的策略为例如，如在Pearson和Reanier,J.Chrom.255:137-149(1983)中所述的天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换HPLC。

经克隆的野生型多肽基因、编码突变多肽的多核苷酸和合成寡核苷酸的序列可以在克隆后使用例如Wallace等人，Gene 16:21-26(1981)的用于对双链模板测序的链终止方法来进行验证。

在一个示例性实施方案中，通过改组多核苷酸来加入糖基化序列。编码候选多肽的多核苷酸可以用DNA改组方案进行调节。DNA改组是递归重组和突变的过程，其通过以下方式执行：对相关基因库进行随机片段化，然后通过类似于聚合酶链式反应的过程来重新装配片段。参见例如，Stemmer,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751(1994)；Stemmer,Nature 370:389-391(1994)；和美国专利第5,605,793号、第5,837,458号、第5,830,721号和第5,811,238号。

b.

已经确定了编码野生型多肽的多种多核苷酸序列，并且所述多核苷酸序列可以从商业供应商获得，例如，人生长激素，例如GenBank登录号NM 000515、NM 002059、NM022556、NM 022557、NM 022558、NM 022559、NM 022560、NM 022561、和NM 022562。

人类基因组研究的迅速进展使得克隆方法成为可能，在所述克隆方法中可以在人类DNA序列数据库中搜索与已知核苷酸序列(例如编码先前鉴定出的多肽的已知核苷酸序列)具有一定序列同源性百分比的任何基因区段。如此鉴定出的任何DNA序列都可以随后通过化学合成和/或聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术，诸如重叠延伸法获得。对于短序列，完全从头合成可能就足够了；然而，为了获得更大的基因，可能有必要使用合成探针从人cDNA或基因组文库中进一步分离出全长编码序列。

或者，可以使用标准克隆技术(诸如聚合酶链式反应(PCR))从人cDNA或基因组DNA文库中分离出编码多肽的核酸序列，其中基于同源性的引物通常可来源于编码多肽的已知核酸序列。用于该目的的最常用技术描述于标准文献中，例如，Sambrook和Russell，出处同上。

适合于获得野生型多肽的编码序列的cDNA文库可以商购获得或可以构建。用于分离mRNA，通过逆转录制备cDNA，将cDNA连接到重组载体中，转染到重组宿主中进行增殖，筛选和克隆的一般方法是众所周知的(参见例如，Gubler和Hoffman,Gene,25:263-269(1983)；Ausubel等人，出处同上)。在通过PCR获得核苷酸序列的扩增区段后，该区段可进一步用作探针以从cDNA文库中分离编码野生型多肽的全长多核苷酸序列。可以在Sambrook和Russell，出处同上中找到适当工序的一般描述。

可以遵循相似的工序以从人基因组文库获得编码野生型多肽，例如上述GenBank登录号中的任何一者的全长序列。人基因组文库是商购可得的，或者可以根据各种本领域公认的方法来构建。通常，为了构建基因组文库，首先从可能发现多肽的组织中提取DNA。然后将DNA进行机械剪切或酶促消化，以产生长度为约12-20kb的片段。随后通过梯度离心将所述片段与不期望大小的多核苷酸片段分离，并插入噬菌体λ载体中。将这些载体和噬菌体进行体外包装。通过噬菌斑杂交来分析重组噬菌体，如Benton和Davis,Science,196:180-182(1977)中所述。如由Grunstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,72:3961-3965(1975)所述地进行菌落杂交。

基于序列同源性，简并的寡核苷酸可以设计为引物组，并且PCR可以在合适的条件下执行(参见例如，White等人，PCR Protocols:Current Methods and Applications,1993；Griffin和Griffin,PCR Technology,CRC Press Inc.1994)，以从cDNA或基因组文库中扩增核苷酸序列的片段。使用扩增的区段作为探针，获得编码野生型多肽的全长核酸。

获得编码野生型多肽的核酸序列后，可将编码序列亚克隆到载体，例如表达载体中，从而可以从所得构建体产生重组野生型多肽。随后可以对野生型多肽编码序列进行进一步的修饰，例如核苷酸取代，以改变分子的特性。

c.

根据编码多核苷酸序列，可以确定野生型多肽的氨基酸序列。随后，可以通过在氨基酸序列中的各个位置处引入附加糖基化序列来修饰该氨基酸序列以改变蛋白质的糖基化模式。

在本领域中建立并描述了多种突变产生方案。参见例如，Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:4504-4509(1997)；和Stemmer,Nature,370:389-391(1994)。该工序可单独使用或组合使用以产生一组核酸的变体，以及由此产生所编码的多肽的变体。用于诱变、文库构建和其他多样性产生方法的试剂盒可商购获得。

产生多样性的突变方法包括例如定点诱变(Botstein和Shortle,Science,229:1193-1201(1985))、使用含尿嘧啶的模板进行诱变(Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488-492(1985))、寡核苷酸定向诱变(Zoller和Smith,Nucl.Acids Res.,10:6487-6500(1982))、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变(Taylor等人，Nucl.Acids Res.,13:8749-8764和8765-8787(1985))，以及使用有缺口的双链DNA进行诱变(Kramer等人，Nucl.Acids Res.,12:9441-9456(1984))。

用于产生突变的其他方法包括点错配修复(Kramer等人，Cell,38:879-887(1984))、使用修复缺陷型宿主菌株进行诱变(Carter等人，Nucl.Acids Res.,13:4431-4443(1985))、缺失诱变(Eghtedarzadeh和Henikoff,Nucl.Acids Res.,14:5115(1986))、限制选择和限制纯化(Wells等人，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A,317:415-423(1986))、通过全基因合成进行诱变(Nambiar等人，Science,223:1299-1301(1984))、双链断裂修复(Mandecki,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:7177-7181(1986))、通过多核苷酸链终止方法进行诱变(美国专利第5,965,408号)、和易错PCR(Leung等人，Biotechniques,1:11-15(1989))。

d.

可以进一步改变编码多肽变体的多核苷酸序列，以与特定宿主的优选密码子使用一致。例如，一种细菌细胞菌株的优选密码子使用可用于衍生编码本发明多肽变体并包括该菌株所偏爱的密码子的多核苷酸。可以通过对宿主细胞表达的大量基因中的优选密码子使用频率进行平均来计算宿主细胞表现出的优选密码子使用频率(例如，计算服务可从Kazusa DNA Research Institute,Japan的网站获得)。该分析优选地限于由宿主细胞高度表达的基因。例如，美国专利第5,824,864号提供了由双子叶植物和单子叶植物表现出的高表达基因的密码子使用频率。

在修饰完成时，通过测序验证多肽变体编码序列，然后将其亚克隆到合适的表达载体中以与野生型多肽相同的方式进行重组生产。

IX.

在序列验证之后，可以使用重组遗传学领域中的常规技术，依靠编码本文所公开的多肽的多核苷酸序列来产生本发明的多肽变体。

a.

为了获得编码本发明突变多肽的核酸的高水平表达，通常将编码突变多肽的多核苷酸亚克隆到表达载体中，所述表达载体含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子和用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子是本领域中众所周知的，并且描述于例如Sambrook和Russell，出处同上和Ausubel等人，出处同上中。用于表达野生型或突变多肽的细菌表达系统可在例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、沙门氏菌属(Salmonella)和柄杆菌属(Caulobacter)中获得。用于这种表达系统的试剂盒是商购可得的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域中众所周知的，并且也可商购获得。在一个实施方案中，真核表达载体是腺病毒载体、腺相关载体、或逆转录病毒载体。

用于指导异源核酸表达的启动子取决于特定的应用。启动子任选地定位为与异源转录起始位点的距离与其在其天然环境中距转录起始位点的距离大约相同。然而，如本领域中已知的，该距离的某种变化可被容许而不丧失启动子功能。

除启动子外，表达载体通常还包括转录单元或表达盒，所述转录单元或表达盒含有在宿主细胞中表达突变多肽所需的所有附加元件。因此，典型的表达盒含有与编码突变多肽的核酸序列可操作地连接的启动子，以及转录物的有效聚腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号。编码多肽的核酸序列通常连接至可切割的信号肽序列，以促进转化的细胞分泌多肽。此类信号肽尤其包括来自组织纤溶酶原活化物、胰岛素和神经元生长因子、以及烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的保幼激素酯酶的信号肽。盒的附加元件可包括增强子，并且，如果基因组DNA用作结构基因，则可包括具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。

除了启动子序列之外，表达盒还应该在结构基因的下游包含转录终止区，以提供用于有效终止。终止区可以从与启动子序列相同的基因获得，或者可以从不同的基因获得。

用于将遗传信息运输到细胞中的特定表达载体不是特别关键。可以使用用于在真核或原核细胞中表达的任何常规载体。标准细菌表达载体包括质粒，例如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D、以及融合表达系统，诸如GST和LacZ。也可以将表位标签添加到重组蛋白中，以提供方便的分离方法，例如c-myc。

含有来自真核病毒的调控元件的表达载体通常用于真核表达载体，例如SV40载体、乳头瘤病毒载体、和衍生自艾普斯登-巴尔病毒的载体。其他示例性真核载体包括pMSG、pAV009/A

在一些示例性实施方案中，表达载体选自pCWin1、pCWin2、pCWin2/MBP、pCWin2-MBP-SBD(pMS

一些表达系统具有提供基因扩增的标记物，例如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。或者，不涉及基因扩增的高产量表达系统也是合适的，诸如昆虫细胞中的杆状病毒载体，其具有在多角体蛋白启动子或其他强杆状病毒启动子的指导下编码突变多肽的多核苷酸序列。

表达载体中通常包含的元件还包括在大肠杆菌中起作用的复制子、编码抗生素抗性以允许选择带有重组质粒的细菌的基因、以及在质粒的非必需区域中的唯一限制性位点以允许插入真核生物序列。所选的特定抗生素抗性基因不是关键的，本领域中已知的许多抗性基因中的任何一种抗性基因都是合适的。

如果需要的话，原核序列任选地经选择为使得它们不干扰DNA在真核细胞中的复制。

当期望重组蛋白(例如，本发明的hgh突变体)的周质表达时，表达载体还包含编码分泌信号(例如大肠杆菌OppA(周质寡肽结合蛋白)分泌信号或其经修饰形式)的序列，所述序列直接连接至要表达的蛋白质的编码序列的5'。该信号序列指导细胞质中产生的重组蛋白通过细胞膜进入周质间隙。表达载体还可包含信号肽酶1的编码序列，所述信号肽酶1在重组蛋白进入周质间隙时能够酶促切割信号序列。关于重组蛋白的周质产生的更详细描述可以在例如，Gray等人，Gene 39:247-254(1985)，美国专利第6,160,089号和第6,436,674号中找到。

如上所述，本领域技术人员将认识到，可以对任何野生型或突变多肽或其编码序列进行各种保守取代，同时仍保留该多肽的生物活性。此外，还可以进行多核苷酸编码序列的修饰以适应特定表达宿主中的优选密码子使用，而不改变所得的氨基酸序列。

b.

使用标准转染方法来产生表达大量突变多肽的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，然后使用标准技术对所述细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系进行纯化(参见例如，Colley等人，J.Biol.Chem.264:17619-17622(1989)；Guide to Protein Purification，Methods in Enzymology，第182卷(Deutscher编著，1990))。真核细胞和原核细胞的转化根据标准技术执行(参见例如，Morrison,J.Bact.132:349-351(1977)；Clark-Curtiss和Curtiss,Methods in Enzymology 101:347-362(Wu等人编著，1983)。

可以使用任何用于将外来核苷酸序列引入宿主细胞中的众所周知的工序。这些工序包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、血浆载体、病毒载体和任何其他众所周知的方法来将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA、或其他外来遗传物质引入宿主细胞(参见例如，Sambrook和Russell，出处同上)。仅需要所使用的特定基因工程化方法能够将至少一种基因成功地引入能够表达突变多肽的宿主细胞中。

c.

将表达载体引入合适的宿主细胞后，在有利于突变多肽表达的条件下培养经转染的细胞。然后筛选细胞中重组多肽的表达，随后使用标准技术从培养物中回收表达重组多肽的细胞(参见例如，Scopes,Protein Purification:Principles and Practice(1982)；美国专利第4,673,641号；Ausubel等人，出处同上；和Sambrook和Russell，出处同上)。

用于筛选基因表达的几种通用方法是本领域技术人员中众所周知的。首先，可以以核酸水平检测基因表达。通常使用各种使用核酸杂交技术进行特异性DNA和RNA测量的方法(例如，Sambrook和Russell，出处同上)。一些方法涉及电泳分离(例如，用于检测DNA的Southern印迹法和用于检测RNA的Northern印迹法)，但是也可以在不进行电泳的情况下(例如通过斑点印迹法)进行DNA或RNA的检测。也可以使用序列特异性引物，通过PCR或RT-PCR来检测经转染的细胞中编码突变多肽的核酸的存在。

其次，可以在多肽水平上检测基因表达。本领域技术人员常规地使用各种免疫测定来测量基因产物的水平，特别是使用与本发明的突变多肽特异性反应的多克隆或单克隆抗体(例如，Harlow和Lane,Antibodies,A Laboratory Manual，第14章，Cold SpringHarbor,1988；Kohler和Milstein,Nature,256:495-497(1975))。此类技术需要通过选择对突变多肽或其抗原部分具有高特异性的抗体来进行抗体制备。产生多克隆和单克隆抗体的方法已被很好地建立，并且它们的描述可以在文献中找到，参见例如，Harlow和Lane，出处同上；Kohler和Milstein,Eur.J.Immunol.,6:511-519(1976)。在随后的部分中提供了制备针对本发明的突变多肽的抗体和进行检测该突变多肽的免疫测定的更详细的描述。

X.

一旦确认了重组突变多肽在经转染的宿主细胞中表达，就以适当规模培养宿主细胞，以实现纯化重组多肽的目的。

a.

当本发明的突变多肽由经转化的细菌大量重组产生时，通常在启动子诱导后，尽管表达可以是组成型的，但是这些蛋白质可能形成不溶性聚集体。有几种适用于纯化蛋白质包涵体的方案。例如，聚集蛋白(以下称为包涵体)的纯化通常涉及提取、分离、和/或通过破坏细菌细胞来纯化包涵体，例如，通过在含有约100-150μg/ml溶菌酶和0.1％NonidetP40(一种非离子型洗涤剂)的缓冲液中孵育。可以使用Polytron研磨机(BrinkmanInstruments,Westbury,NY)研磨细胞悬液。或者，可以在冰上对细胞进行超声处理。替代的裂解细菌的方法在Ausubel等人和Sambrook和Russell，均出处同上中进行了描述，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

对于从细菌包涵体纯化重组多肽的进一步描述，参见例如，Patra等人，ProteinExpression and Purification 18:182-190(2000)。

可通过本领域技术人员众所周知的标准分离技术将存在于上清液中的重组蛋白与宿主蛋白分离。

b.

为了证实重组突变多肽的产生，免疫测定可用于检测样品中多肽的表达。免疫测定也可用于定量重组激素的表达水平。抗突变多肽的抗体对于进行这些免疫测定是必需的。

c.

产生与感兴趣的免疫原特异性反应的多克隆和单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的(参见例如，Coligan,Current Protocols in Immunology Wiley/Greene,NY,1991；Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press,NY,1989；Stites等人(编著)Basic and Clinical Immunology(第4版)Lange MedicalPublications,Los Altos,CA，以及其中所引用的参考文献；Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice(第2版)Academic Press,New York,NY,1986；以及Kohler和Milstein Nature 256:495-497,1975)。此类技术包括通过从在噬菌体或类似载体中的重组抗体的文库中选择抗体来进行抗体制备(参见，Huse等人，Science 246:1275-1281,1989；和Ward等人，Nature 341:544-546,1989)。

为了产生含有具有所需特异性的抗体的抗血清，可以使用感兴趣的多肽(例如，本发明的突变多肽)或其抗原片段来免疫合适的动物，例如小鼠、兔子或灵长类动物。可以根据标准免疫方案使用标准佐剂，例如弗氏佐剂。或者，可以将源自该特定多肽的合成抗原肽缀合至载体蛋白，然后用作免疫原。

通过取测试出血并测定对感兴趣的抗原的反应性的滴度来监测动物对免疫原制备物的免疫应答。当获得针对抗原的适当高滴度的抗体时，从动物中收集血液并制备抗血清。随后可以进行抗血清的进一步分级以富集对抗原具有特异性反应性的抗体并纯化所述抗体，参见，Harlow和Lane，出处同上，以及上文提供的蛋白质纯化的一般描述。

使用本领域技术人员熟悉的各种技术获得单克隆抗体。通常，通常通过与骨髓瘤细胞融合来使来自用期望的抗原免疫的动物的脾细胞永生化(参见，Kohler和Milstein,Eur.J.Immunol.6:511-519,1976)。永生化的替代方法包括例如用艾普斯登-巴尔病毒、致癌基因或逆转录病毒进行转化、或本领域熟知的其他方法。针对具有所需的对抗原的特异性和亲和力的抗体的产生对来自单一永生化细胞的菌落进行筛选，并且可以通过多种技术(包括注射入脊椎动物宿主的腹膜腔中)来提高由此类细胞产生的单克隆抗体的产率。

另外，通过根据由Huse等人，出处同上概述的一般方案筛选人B细胞cDNA文库，在鉴定编码具有所需特异性的抗体或此类抗体的结合片段的核酸序列时，也可以重组地产生单克隆抗体。以上讨论的重组多肽产生的一般原理和方法适用于通过重组方法产生抗体。

当需要时，可以测试能够特异性识别本发明突变多肽的抗体与野生型多肽的交叉反应性，并由此与针对野生型蛋白的抗体区分开。例如，从用突变多肽免疫化的动物获得的抗血清可以穿过固定有野生型多肽的柱。穿过柱的抗血清部分仅识别突变多肽，而不识别野生型多肽。类似地，还可针对排他地仅识别突变体而不识别野生型多肽来对抗突变多肽的单克隆抗体进行筛选。

仅特异性识别本发明的突变多肽而不识别野生型多肽的多克隆或单克隆抗体可用于从野生型蛋白中分离突变蛋白，例如通过将样品与固定在固体载体上的突变肽特异性多克隆或单克隆抗体一起孵育。

XI.

在各种实施方案中，本发明提供了预防、改善或治疗疾病状态的方法，所述疾病状态可以通过抑制Met和/或FGFR，通过施用FGF1变异多肽和HGF变异多肽的联合疗法来治疗。在这些实施方案中，本发明提供了一种方法，所述方法包括向有需要的受试者施用足以预防、改善或治疗疾病状态的量的本发明的FGF1变异多肽和HGF变异多肽。示例性疾病状态是癌症。所公开的激动剂变体可用于促进细胞生长，特别是用于血管生成，以及用于治疗心血管、肝、肌肉骨骼和神经元疾病。

在一些实施方案中，将FGF1变异多肽和HGF变异多肽的联合疗法用于治疗、预防、和/或抑制(1)持续性角膜上皮缺损(PCED)，以及(2)角膜血管新生。在一些实施方案中，PCED是等同于足部的不愈合(例如，糖尿病性)溃疡的眼病。在一些实施方案中，当上皮愈合和缺损闭合的过程延迟时发生PCED，从而导致可导致溃疡、感染、瘢痕形成、穿孔和视力丧失的角膜上皮缺损。在一些实施方案中，PCED可以由损伤、先前的眼科手术、感染(例如先前的疱疹感染或严重的细菌性溃疡)或眼部疾病(包括潜在的病症，诸如严重的干眼症、糖尿病、由于眼睑病理学引起的慢性暴露，以及造血干细胞移植后的眼移植物抗宿主病)造成。在一些实施方案中，将FGF1变异多肽和HGF变异多肽的联合疗法用于治疗、预防、和/或抑制损伤、先前的眼科手术、感染(例如先前的疱疹感染或严重的细菌性溃疡)或眼部疾病(包括潜在的病症，诸如严重的干眼症、糖尿病、由于眼睑病理学引起的慢性暴露，以及造血干细胞移植后的眼移植物抗宿主病)。

例如，在成年人中，HGF-Met途径参与损伤后的肌肉再生。因此，所公开的变体可用于修复肌肉损伤，包括例如梗塞后的心脏组织再生。

所公开的变体可以用于例如治疗或预防由包括病毒感染(诸如被肝炎病毒，例如HAV、HBV或HCV感染)或其他急性病毒性肝炎、自身免疫性慢性肝炎、妊娠的急性脂肪肝、Budd-Chiari综合征和静脉阻塞性疾病、过热、缺氧、恶性浸润、Reye综合征、败血症、威尔逊氏病和移植排斥的病症引起的肝衰竭或疾病。

所公开的变体可以用于治疗或预防由毒素诱发的急性肝衰竭或疾病，所述毒素包括选自以下的毒素：蘑菇中毒(例如，鬼笔鹅膏(Amanita phalloides))、砷、四氯化碳(或其他氯化烃)、铜、乙醇、铁、甲氨蝶呤和磷。本发明的多肽的特定用途是治疗或预防由N-乙酰基-对氨基苯酚(商业上称为对乙酰氨基酚(paracetamol/acetaminophen))中毒引起的肝损害。

此外，所公开的变体可用于肾衰竭后的治疗中，从而支持肾脏的维持和再生。

因为本发明的多肽变体中和了HGF的活性，所以它们可以用于各种治疗应用中。例如，本发明的某些多肽变体可用于预防或治疗过度增殖性疾病或疾患，例如各种形式的癌症。

在一个示例性实施方案中，本发明提供了一种在需要这种治疗的受试者中治疗癌症的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的多肽变体。

预期本发明的多肽变体可用于治疗多种FGF反应性疾患，包括例如多种眼部疾患，肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、肝癌、胃癌、食道癌、肾癌、鼻咽癌、胰腺癌、间皮瘤、黑素瘤和成胶质细胞瘤中的FGF反应性肿瘤细胞。

在示例性实施方案中，癌症是癌，例如，结直肠癌、鳞状细胞癌、肝细胞癌、肾癌、乳腺癌或肺癌。

多肽变体可用于抑制或减少肿瘤细胞的增殖。在这种方法中，将肿瘤细胞暴露于治疗有效量的多肽变体，以抑制或减少肿瘤细胞的增殖。在某些实施方案中，多肽变体抑制肿瘤细胞增殖达至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。

在某些实施方案中，该多肽变体用于抑制或减少肿瘤细胞的增殖，其中该变体降低了FGF1与FGFR结合的能力。在某些实施方案中，FGF1多肽变体用于抑制或促进创伤愈合。

另外，多肽变体可用于抑制或减慢哺乳动物中的肿瘤生长或发育。在这种方法中，将有效量的多肽变体施用于哺乳动物，以抑制或减慢哺乳动物中的肿瘤生长。因此，多肽变体可用于治疗例如哺乳动物中的肿瘤。该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的多肽变体。多肽变体可以单独施用或与另一种药物活性分子联合施用，以治疗肿瘤。

通常，多肽变体的治疗有效量将在约0.1mg/kg至约100mg/kg，任选地约1mg/kg至约100mg/kg，任选地约1mg/kg至10mg/kg的范围内。施用的量将取决于变量，诸如待治疗的疾病或适应症的类型和程度、特定患者的总体健康状况、所递送的多肽变体的相对生物学功效、多肽变体的制剂、制剂中赋形剂的存在和类型、以及施用途径。为了迅速达到所需的血液水平或组织水平，可以将所施用的初始剂量增加到超过上限水平，或者初始剂量可以小于最佳值，并且每日剂量可以在治疗过程期间逐渐增加，这取决于具体情况。可以优化人剂量，例如在常规I期剂量递增研究中设计为0.5mg/kg至20mg/kg。投药频率可以变化，这取决于诸如施用途径、剂量量和所治疗疾病状况的因素。示例性的投药频率是每天一次、每周一次和每两周一次。优选的施用途径是肠胃外施用，例如静脉内输注。基于蛋白质的药物的制剂在本领域普通技术范围内。在本发明的一些实施方案中，将多肽变体，例如基于蛋白质的多肽冻干，并在施用时，在缓冲盐水中重构。

多肽变体可以单独施用或与其他药物活性成分联合施用。其他活性成分，例如免疫调节剂，可以与多肽变体一起施用，或者可以在多肽变体之前或之后施用。

包含用于治疗用途的多肽变体的制剂通常包括与药学上可接受的载体组合的多肽变体。如本文所用，“药学上可接受的载体”是指在合理医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触地使用而没有过量毒性、刺激性、过敏反应、或其它问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的缓冲液、载体和赋形剂。载体必须是在与制剂的其它成分相容并且对其接受者无害的意义上“可接受的”。在这方面，药学上可接受的载体打算包括可与医药施用相容的任何和所有缓冲液、溶剂、分散介质、包衣、等张剂和吸收延迟剂等。用于药学活性物质的此类介质和剂的用途是本领域已知的。

所述制剂可以方便地以剂量单位形式存在，并且可以通过任何合适的方法来制备，所述合适的方法包括药学领域中众所周知的任何方法。Remington’s PharmaceuticalSciences,第18版(Mack Publishing Company,1990)。

在示例性实施方案中，多肽变体用于体外或体内诊断目的，通常用可检测部分直接或间接地标记多肽变体。可检测部分可以是能够直接或间接产生可检测信号的任何部分。例如，可检测部分可以是放射性同位素，诸如

多肽变体可用于本领域可用的多种免疫测定技术中。示例性免疫测定包括例如夹心免疫测定、竞争性免疫测定、免疫组织化学工序。

在夹心免疫测定中，使用了两种结合感兴趣的分析物或抗原的抗体，例如，一种固定在固体载体上，另一种游离在溶液中并用可检测部分标记。当将包含抗原的样品引入该系统时，抗原与固定化的抗体和标记的抗体两者结合，从而在载体的表面上形成“夹心”免疫复合物。通过洗去未结合的样品组分和过量的标记抗体，并测量与载体表面上的蛋白质复合的标记抗体的量，来检测复合蛋白。或者，可以通过用结合游离抗体的可检测部分标记的第三抗体来检测溶液中游离的抗体。可以在许多文献中找到对免疫测定设计、理论和方案的详细综述，所述文献包括Butt编著，(1984)Practical Immunology,Marcel Dekker,New York；Harlow等人编著，(1988)Antibodies,A Laboratory Approach,Cold SpringHarbor Laboratory；和Diamandis等人编著，(1996)Immunoassay,Academic Press,Boston。

预期标记的多肽变体可用作体内显像剂，由此多肽变体可将显像剂靶向至接受者中特定的感兴趣的组织。用于体内成像的远程可检测部分包括放射性原子

在体内成像中也有用的非放射性部分包括氮氧化物自旋标记以及镧系元素和过渡金属离子，所有这些都可诱导原位质子弛豫。除了成像外，复合的放射性部分还可用于标准放射免疫疗法方案中以破坏靶细胞。

各种各样的荧光标记为本领域中已知的，包括但不限于异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛以及荧光胺。有用的化学发光标记可包括鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐或草酸酯。

公开的多肽变体也可以用荧光标记物标记，以允许进行体内检测。在一些实施方案中，荧光标记是Cy5.5(GE Healthcare)。在其他实施方案中，荧光标记是Alexa

用于高剂量放射疗法的示例性核苷酸包含放射性原子

实施例

实施例1：用于工程化蛋白水解稳定的生长因子的高通量筛选方法

摘要

生长因子是一类重要的调节蛋白，其具有巨大的潜力开发作为用于再生医学和癌症治疗的治疗分子。然而，生长因子作为治疗分子的活性和功效由于其差的热稳定性和蛋白水解稳定性而受到极大限制。尽管已经开发出许多方法来工程化具有增加的热稳定性的生长因子，但是缺乏对工程化具有增加的蛋白水解稳定性的生长因子的关注和方法开发。蛋白酶(诸如纤溶酶、弹性蛋白酶、uPA、组织蛋白酶和MMP)在细胞外基质降解和信号转导中(尤其是在创伤愈合和肿瘤形成中)起关键作用。据报道，这些蛋白酶通常还降解生长因子。在这项工作中，描述了一种用于工程化生长因子以实现增加的蛋白水解稳定性的可归纳方法。利用酵母展示平台和FACS筛选作为组合方法来选择具有增加的蛋白水解稳定性的突变体。通过证明筛选以区分野生型FGF1和文献报道的蛋白水解稳定的FGF1突变体的能力来验证该方法。

简介

该实施例描述了一种组合方法，该组合方法使用酵母展示平台和流式活化细胞分选(FACS)进行筛选来工程化蛋白水解稳定的生长因子。说明了使用FGF1作为模型示例的筛选方法的设定过程。由于FGF1具有极差的热稳定性和蛋白水解稳定性，因此针对FGF1设置筛选

结果

用于工程化蛋白水解稳定的蛋白质的组合筛选方法的工作流

酵母展示平台通常用于工程化高亲和力的结合物，也可用于工程化具有更高蛋白水解稳定性的蛋白质(图1)。单一生长因子变体的数千个拷贝作为系留融合体展示在酵母的表面上。血凝素(HA)标签在生长因子的上游表达，而c-myc标签在生长因子的下游表达。可以将细胞与对应受体的可溶性Fc融合体一起孵育，该融合体可以与酵母展示的生长因子结合。

酵母展示平台与流式活化细胞分选(FACS)组合，以工程化具有更高蛋白水解稳定性的生长因子(图2)。生长因子突变体文库是通过随机诱变、定向诱变或DNA改组生成的。将酵母细胞文库与感兴趣的蛋白酶一起孵育，在此期间发生了对酵母表面展示的蛋白质的切割。具有更大蛋白水解稳定性的生长因子突变体对酵母细胞表面上的切割具有更高的抗性。在蛋白酶孵育后，将细胞洗涤并与功能性受体的可溶性Fc融合体一起孵育，所述功能性Fc融合体与具有保留的受体结合亲和力的正确折叠的生长因子突变体结合。FACS用于分选正确折叠、未切割的生长因子突变体，将所述生长因子突变体扩增并诱导用于下一轮分选。

使用针对Fc结构域、c-myc结构域和HA标签的荧光抗体标记物来测量受体结合、生长因子特异性切割和非特异性切割(表2.1)。对结合的Fc融合受体的检测对于确保生长因子的突变不会严重降低对该受体的结合亲和力或导致不正确的蛋白质折叠至关重要。生长因子特异性切割是生长因子的蛋白水解稳定性的直接度量。它通过c-myc信号检测，因为经切割的生长因子的C末端c-myc标签将被去除。当蛋白酶在酵母表面展示蛋白Aga1p和Aga2p内切割时，发生非特异性切割。在非特异性切割期间，所有三个标记物的荧光信号均降低。这是非期望的，因为用于检测生长因子切割和结合活性的动态范围减小了。因此，使用HA信号来确保感兴趣的蛋白酶的非特异性切割最小。

FGF1的酵母展示

选择FGF1作为模型来演示蛋白水解稳定性筛选的设置。将野生型FGF1克隆到pCT载体中，以在酿酒酵母(S.cerevisiae)酵母细胞的表面上作为与Aga2p接合蛋白的融合体表达(图3A)。通过检测蛋白质的C末端上的c-myc标签，确认了FGF1在酵母细胞表面上的成功表达(图3B)。最后，通过测量对FGFR1-Fc的特异性结合活性，确认了酵母展示的FGF的正确折叠(图3C)。

用于工程化蛋白水解稳定的FGF1的蛋白酶的选择

测试了使用血清、胰蛋白酶、糜蛋白酶和纤溶酶来开发FGF1的蛋白水解稳定性筛选。这些蛋白酶是基于其与FGF1的科学和生物学相关性而选择的。蛋白酶对筛选的适合性是通过其以对酵母展示蛋白的最小非特异性切割、以合理的速率切割生长因子的能力来确定的。

首先尝试使用血清开发筛选，血清是一种由多种蛋白酶组成的天然血液产品，所述蛋白酶可能会在体内被生长因子遇到

接下来，测试了使用胰蛋白酶和糜蛋白酶开发筛选，这两种蛋白酶通常用于测量和报告蛋白质的蛋白水解稳定性。将酵母展示的野生型FGF1与各种浓度的胰蛋白酶(图5)和糜蛋白酶(图6)一起孵育，然后测量了蛋白切割(α-c-myc)和与FGFR1-Fc结合的程度。发现，胰蛋白酶和糜蛋白酶都对观察到的蛋白切割和与FGFR1-Fc结合的程度具有浓度依赖性效应。然后，确定观察到的蛋白切割是由于非特异性切割(α-HA)还是FGF1特异性切割(α-c-myc)引起的。发现，与更高浓度的胰蛋白酶一起孵育时，HA信号显著降低，表明观察到的蛋白质切割中由胰蛋白酶进行的许多蛋白质切割是由于非特异性切割所致(图7)。因此，得出结论，胰蛋白酶不能用于蛋白水解稳定性筛选。同时，发现只有c-myc信号降低，而HA信号相对不受与较高浓度的糜蛋白酶一起孵育的影响，表明糜蛋白酶对蛋白质的切割主要归因于FGF1内的切割(图8)。因此，得出结论，糜蛋白酶是用于蛋白水解稳定性筛选的合理候选物。

最后，评估了使用纤溶酶的蛋白水解稳定性筛选的开发，纤溶酶是一种降解细胞外基质蛋白的蛋白酶，并且据报道降解FGF1

通过区分野生型FGF1和蛋白水解稳定的FGF1突变体来验证筛选方法

为了测试基于纤溶酶的筛选区分具有不同蛋白水解稳定性的FGF的能力，比较了野生型(WT)FGF1与文献中通过合理设计开发的热稳定的FGF1突变体(PM2)

将展示PM2或WT FGF1的酵母细胞与不同浓度的纤溶酶一起孵育48小时，并进行非特异性切割(抗HA)和FGF1特异性切割(抗c-myc)染色(图11)。发现通过c-myc信号的差异可获得群体的干净分离，其中具有相对较小的对HA信号的影响。切割信号的这种差异证实了使用纤溶酶将使得筛选能够正确识别具有更大的蛋白水解稳定性的新FGF突变体，并通过FACS对这些群体进行分选。

讨论

在此实施例中，描述了使用酵母展示平台和流式活化细胞分选对蛋白水解稳定的生长因子进行工程化的高通量可归纳筛选方法的开发。例如，提供了用于FGF1(一种高度不稳定的生长因子)筛选的设置。

在建立用于感兴趣的生长因子的筛选时，第一步骤是确保生长因子可以在酵母表面上表达，并且其能够结合其受体的可溶形式。证实了FGF1可以作为与Aga2酵母展示蛋白的C末端融合体在pCT载体中表达，并且它与FGFR1-Fc特异性结合。在过去，VEGF、EGF和HGF已通过酵母展示成功地表达

第二步骤是确定用于蛋白水解筛选的蛋白酶。测试了血清、胰蛋白酶、糜蛋白酶和纤溶酶用于工程化经酵母展示的FGF1的用途。发现胎牛血清(FBS)即使在高浓度下也提供过弱的选择压力。尽管在FBS中发现了蛋白酶，但在FBS中发现的蛋白酶抑制剂，诸如α-1-抗蛋白酶和α-1-抗糜蛋白酶，可能会使它们的活性降低

筛选设置中的最终步骤是确定是否可以区分具有不同蛋白水解稳定性的生长因子突变体。该任选步骤提供了重要的基准，所述基准对进行筛选以选择蛋白水解稳定的突变体的能力提供了信心。对于FGF1，证实了PM2(一种具有增加的热稳定性和蛋白水解稳定性的FGF1突变体)当在酵母的表面上展示时可与野生型FGF1区别开来。在没有可用的蛋白水解稳定的生长因子突变体的情况下，只要蛋白酶显示出高生长因子特异性切割和对经酵母展示的蛋白的低非特异性切割，筛选就仍可进行。在实施例2中，报告了使用已经开发的方法来工程化FGF1以实现蛋白水解稳定性。

材料和方法

酵母展示构建体的克隆

将FGF1从人FGF1 cDNA(MGC克隆：9218，图像：3896359，残基：Phe16至Asp155)克隆到pCT载体(限制性位点：NheI、BamHI)中以进行酵母展示。对于蛋白水解稳定的FGF1突变体PM2，使用定点诱变对FGF1进行突变Q40P(CAA到CCA)、S47I(TCC到ATC)和H93G(CAT到GGT)。

用于经酵母展示的FGF1的结合测定

将50,000个经诱导的酵母细胞与不同浓度的人FGFR1β(IIIc)-Fc(R&D Systems)一起在含有1g/L BSA的磷酸盐缓冲盐水(PBSA)中在室温下孵育。将细胞以足够大的体积孵育以避免配体耗竭，并进行足够长的时间(通常3至24小时)以达到平衡。在孵育的最后30分钟期间，将酵母细胞与鸡抗c-Myc(Invitrogen)在PBSA中的1:2500稀释液一起孵育。将酵母沉淀，洗涤，然后与二级抗体的1:200稀释液在冰上一起孵育10分钟，所述二级抗体为：抗人IgG-FITC(Sigma Aldrich)和针对抗c-myc的抗鸡IgY-PE(Santa Cruz Biotechnology)。将酵母洗涤、沉淀并重悬于PBSA中，然后立即使用EMD Millipore Guava EasyCyte通过流式细胞术进行分析。使用FlowJo(v7.6.1)分析流式细胞术数据。将结合曲线作图，并使用GraphPad Prism 6获得K

用于筛选的蛋白水解稳定性测定

将胎牛血清(Gibco)、来自牛胰腺的胰蛋白酶(Sigma Aldrich)、来自牛胰脏的糜蛋白酶VII型(Sigma Aldrich)或来自人血浆的纤溶酶(Sigma Aldrich)用作蛋白酶或蛋白酶混合物进行孵育。在杜氏改良伊格尔培养基(Gibco)中稀释胎牛血清。将胰蛋白酶和糜蛋白酶在胰蛋白酶缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 8)，1mM CaCl

在适当的缓冲液中，将一百万个诱导的酵母细胞与各种浓度的蛋白酶一起孵育。在孵育结束时，将细胞用PBSA (PBS+0.1％BSA)洗涤一次，并重悬于缓冲液蛋白酶抑制剂混合物(Sigma Aldrich)中以猝灭残留的蛋白酶活性。5分钟后，再次用PBSA洗涤细胞。对于仅测量FGFR结合活性的实验，将细胞在10nM人FGFR1β(IIIc)-Fc(R&D Systems)的pBSA溶液中孵育1小时。在最终洗涤后，将细胞与适当的荧光抗体一起孵育。

对于测量FGFR1结合活性和c-myc信号的实验，将细胞与鸡抗c-Myc(Invitrogen)在PBSA中的1∶2000稀释液一起孵育30分钟。洗涤后，将细胞在二级抗体中于冰上孵育10分钟，所述二级抗体为：抗人IgG-FITC(Sigma Aldrich)和针对抗c-myc的抗鸡-IgY-PE(SantaCruz Biotechnology)。

对于测量HA和c-myc信号的实验，将细胞与抗HA-标签(6E2)小鼠mAb(CellSignaling)的1∶1000稀释液和鸡抗c-Myc(Invitrogen)的1∶2000稀释液一起孵育30分钟。在洗涤后，将细胞在二级抗体中于冰上孵育10分钟，所述二级抗体为：山羊抗小鼠-PE(Invitrogen)和山羊抗鸡-IgY-AlexaFluor488(Santa Cruz Biotechnology)。

将酵母洗涤、沉淀并重悬于PBSA中，然后立即使用EMD Millipore GuavaEasyCyte通过流式细胞术进行分析。使用FlowJo(v7.6.1)分析流式细胞术数据。将结合曲线作图，并使用GraphPad Prism 6获得K

表6.不同事件对从荧光抗体标记物观察到的信号的影响。

实施例2：工程化蛋白水解稳定的成纤维细胞生长因子

摘要

FGF1在创伤愈合、组织再生、肿瘤形成和其他血管生成依赖性疾病期间在细胞分化和诱导血管生成中起重要作用。因此，基于FGF1的激动剂和拮抗剂可具有用于细胞培养和蛋白质疗法的重要应用。然而，据报道当暴露于培养物中的蛋白酶时，FGF1表现出对降解的易感性。它的不良蛋白水解稳定性可阻碍它们在细胞培养物中或当作为治疗分子开发时的活性和功效。在该实施例中，使用实施例1中所述的基于酵母展示的筛选方法对FGF1肽进行蛋白水解稳定性工程化。探索了用于选择蛋白水解稳定的FGF并成功鉴定出用于表征的候选物的选通策略。

简介

成纤维细胞生长因子(FGF)是重要的生长因子家族的一部分，该家族调节生物活性，所述生物活性包括胚胎发育、细胞分化、细胞增殖、细胞迁移、血管生成、新陈代谢和创伤愈合

FGF1据报道保护功能性血管免于退化，诱导动脉生长和促进毛细血管增殖

尽管FGF1在诱导血管生成以进行创伤愈合和组织再生方面具有潜力，但是利用FGF1作为治疗剂的努力在很大程度上没有成功。I期和II期临床研究表明，以编码FGF1的可注射肌内质粒形式进行基因疗法可改善晚期下肢缺血患者的灌注并且减少截肢的需要

重组FGF1无法在许多临床应用中有效可能部分地源于其不良稳定性。野生型FGF1在条件培养基或培养物中于37℃孵育后迅速降解，其中降解半衰期为约25分钟

该实施例描述了使用实施例1中所述的开发的筛选方法对FGF1进行工程化以实现提高的针对纤溶酶的蛋白水解稳定性。使用酵母表面展示平台对FGF1进行工程化以建立基因与蛋白质的连接。筛选每种生长因子的随机诱变文库中的FGFR1结合物，然后筛选与蛋白酶一起孵育后仍保持未切割的突变体，最后筛选与蛋白酶一起孵育后仍未切割并保留FGFR1结合的突变体。鉴定了几个有前途的突变，所述突变似乎增加了每种生长因子的蛋白水解稳定性，并产生了用于如实施例3中所述的表征的候选物。

结果

野生型FGF的酵母展示和随机诱变文库的产生

正确折叠的野生型FGF1的成功酵母展示如下所述。将易错PCR与核苷酸类似物一起用于在野生型FGF1中随机产生突变。生成了具有3.3×10

种类1：针对FGFR1-Fc结合物的选择

对于第一种类，针对保留对FGFR1-Fc的结合亲和力对FGF1突变体进行分选(图12A)。假设大多数随机突变将导致结合亲和力的损失。与FGFR1-Fc一起孵育后，选通并收集了显示高表达(α-c-myc)和高结合信号(α-FGFR1-Fc)的细胞。对于FGF1文库，观察到了作为非结合物的突变体与保留FGFR结合亲和力的突变体之间的清晰分离(图12B)。

种类2：针对FGF1特异性切割抗性的选择。

对于第二种类，扩增来自种类1的细胞，并分选在与纤溶酶一起孵育后仍保持抗切割能力的FGF1突变体(图13A)。为了获得有效的动态范围并区分具有不同蛋白水解稳定性的突变体，以不同的浓度和孵育时间测试细胞的孵育。发现对于FGF1文库，与400nM纤溶酶一起孵育36小时对于在切割的和未切割的突变体的群体之间实现清晰分离是必要的(图13B)。收集表现出最高水平的蛋白酶抗性的顶部1-2％的细胞(高α-c-myc)，通过表达水平(α-HA)归一化。

在筛选期间分离肽伪影。

扩展第二种类的FGF1文库，并使用HA和c-myc信号进行另一轮FGF1特异性切割抗性的选择。与200nM纤溶酶一起孵育36小时时，清楚地观察到，一细胞群体与文库的其余部分相比显示出高得多的c-myc信号，表明了经酵母展示的蛋白对纤溶酶切割的抗性明显更大(图14A)。收集该群体并对单独克隆进行测序以进行分析(图14B)。发现大多数细胞在其细胞表面上不表达FGF2突变体，而是替代地表达在随机诱变期间可能已经产生的短肽伪影。

证实了这些肽没有表现出对FGFR1-Fc的任何特异性结合，表明针对FGF1特异性切割抗性的分选导致表达这些肽伪影的非常小的细胞群体的快速富集(图15)。因此，对于所有后续种类，继续包括用于保留FGFR1结合亲和力的选择压力。

种类3-4：针对耐蛋白酶的FGFR1-Fc结合物的选择

对于其余的种类3和种类4，将文库与纤溶酶一起孵育，随后与FGFR1-Fc一起孵育，然后再进行选择(图16)。使用α-HA、α-c-myc和α-FGFR1-Fc的不同组合选择仍保持未切割并保留对FGFR1的结合亲和力的FGF1突变体。

对于FGF1的第三种类，扩增了来自种类2的细胞，并分选了与纤溶酶一起孵育后保留FGFR1结合的FGF突变体(图17)。用较高浓度的纤溶酶执行12小时孵育。最终将1.5μM纤溶酶用于分选FGF1文库。选通并收集了显示高结合信号(α-FGFR1-Fc)和高表达(α-HA)的细胞。

对于FGF1的第四种类，扩增了来自种类3的细胞，并将纤溶酶孵育时间从12小时增加到36小时。将来自种类3的细胞在1.5μM纤溶酶或500nM纤溶酶中孵育。最终分选了与500nM纤溶酶一起孵育的细胞(图18)。选通并收集了显示高切割抗性(α-c-myc)和高结合信号(α-FGFR1-Fc)的细胞。通过种类4，已就FGF1文库达成了完全共识，并且利用该完全共识执行附加分选轮次。

经分选的FGF1突变体的序列分析

对于最后的种类4，随机选择单独克隆并进行序列分析。能够在四轮分选中达成完全共识。突变体(BS4M1)包含两个突变：D28N和L131R(图19)。天冬氨酸28是封闭FGF1的六链β桶结构的三个关键β发夹中的第一β发夹(LPDG)的一部分。在FGF1的N末端与C末端之间的β链对中发现了亮氨酸131。

讨论

在该实施例中，描述了对FGF1进行工程化以实现抗纤溶酶的蛋白水解稳定性。作为第一步骤，能够成功表达野生型FGF1和野生型FGF2。通过检测用于针对FGFR1-Fc或sFGFR3-D2D3-Fc的特异性结合的c-myc标签测试，证明蛋白质成功表达并正确折叠。观察到FGF1表现出相对较高的表达信号，这是有趣的，因为FGF1被认为是不稳定的，具有短的半衰期和低的解链温度

通过酵母展示实现的FGF1高表达导致在FGF1随机诱变文库的分选和后续分选期间产生了良好的信号动态范围。所述FGF1种类可以经受高浓度的纤溶酶和较长的孵育时间，以提高严格性。这在种类2中是特别有价值的，其中实现了经切割的FGF1突变体和未切割的FGF1突变体之间的清晰分离。

尽管进行了初始轮分选以选择种类1中的FGFR结合物，发现仅使用HA和c-myc信号来测量切割会导致所述种类中的非FGFR结合肽的迅速富集。仅在两种此类种类中，鉴定出了表达肽的群体与文库其余部分之间的清晰分离。尽管文库是通过以野生型FGF作为支架进行随机诱变而构建的，但是随机诱变过程中的罕见错误可能导致表达肽伪影的极小细胞群体。虽然这些伪影对于用于亲和力成熟的更传统酵母展示筛选而言几乎没有什么意义，但是它们在没有用于受体结合的选择压力的情况下迅速变得显著。因此，得出的结论是，用于测量结合亲和力的选择压力是必不可少的，并且应通过仅基于切割活性选择突变体来进行不超过一种分选。

通过筛选过程，确定了几个富集的突变，所述突变可为对于改善蛋白水解稳定性重要的。有趣的是，在蛋白质的β环区域或C末端附近发现了突变，所述β环区域和C末端被认为是确定蛋白质稳定性的关键区域。对于FGF1文库，已在四轮分选内达成了完全共识。FGF1BS4M1突变体包含两个突变：D28N和L131R。天冬氨酸28是封闭FGF1的六链β桶结构的三个关键β发夹中的第一β发夹(LPDG)的一部分。先前已经研究过Asx-Pro-Asx-Gly基序在其对FGF1稳定性的贡献中的重要性，并且已经证明用丙氨酸替代Asx残基会极大地破坏FGF1的稳定性

总之，已证明蛋白水解稳定性筛选能够成功地富集在文献中被报道为对FGF1蛋白稳定性重要的位置中的突变。在实施例3中，表征了在最终的FGF1BS4M1突变体中鉴定出的突变对可溶性表达的FGF1的稳定性和配体调节FGF途径的能力的影响。

材料和方法

蛋白质的酵母表面展示

YPD培养基由20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨和10g/L酵母提取物组成。选择性SD-CAA培养基由以下物质组成：20g/L葡萄糖、6.7g/L不含氨基酸的酵母氮源基础(Difco)、5g/L酪蛋白氨基酸(Bacto)、5.4g/L Na

通过电穿孔将pCT酵母展示质粒转化到酿酒酵母菌株EBY100中，并在30℃下在YPD中回收1小时，然后铺板在SD-CAA板上。3天后，将酵母菌落接种在SD-CAA中过夜。根据确定的方案

文库创建

将FGF1从人FGF1 cDNA(MGC克隆：9218，图像：3896359，残基：Phe16至Asp155)克隆到pCT载体(限制性位点：NheI、BamHI)中以进行酵母展示。FGF1随机诱变文库是使用易错PCR生成的，如先前所述

文库筛选

将展示FGF1突变体的经诱导的EBY100酵母细胞与纤溶酶一起在纤溶酶消化缓冲液(100mM Tris-HCl、0.01％BSA，pH 8.5)中在37℃下孵育和/或在FGFR1-Fc的PBS+0.1％BSA(PBSA)溶液中在室温下孵育，如针对每种种类所述。在蛋白酶消化步骤后，将细胞用PBSA洗涤，与蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)在PBSA中的1:100稀释液中孵育5分钟，然后再次用PBSA洗涤。在FGFR孵育步骤后，将细胞用PBSA洗涤。针对每种种类所孵育的酵母细胞数为约10×前一种类中所收集的细胞数量。将细胞以200万个细胞/mL的密度孵育。在所有孵育步骤之后，将细胞用一级抗体和二级抗体染色。为了进行初步染色，将细胞合适地与抗HA-标签(6E2)小鼠mAb(Cell Signaling)的1:1000稀释液和/或鸡抗c-Myc(Invitrogen)的1:2000稀释液一起孵育30分钟。初步染色后，用PBSA洗涤细胞。在冰上进行二次染色10分钟。对于二次染色，针对每种种类使用以下抗体：种类1、3、4—针对抗c-myc的抗鸡-IgY-PE(Santa Cruz Biotechnology)和针对FGFR1-Fc的抗人IgG-FITC(Sigma Aldrich)；种类2—山羊抗小鼠-PE(Invitrogen)和山羊抗鸡-IgY-AlexaFluor488(Santa CruzBiotechnology)。

使用BD FACS Aria II(Stanford Shared FACS Facility)，通过荧光活化细胞分选(FACS)对标记的酵母细胞进行分选。在每种种类中，基于针对每种种类设置的标准，收集0.5％至10％的酵母细胞。使每种种类中收集的细胞在SD-CAA(pH 5，用以限制细菌污染)中生长几天，直到达到为5至8的OD。在下一轮分选之前，在30℃下诱导克隆在SG-CAA中进行酵母展示表达24小时。

为了测序和克隆，使用Zymoprep酵母质粒Miniprep I试剂盒(Zymo Research)从酵母细胞中提取质粒DNA。将提取的DNA转化入DH10B电感受态细胞并铺板。选择单个菌落并在LB培养基(Fisher Scientific)中生长。使用质粒miniprep试剂盒(GeneJet)从单菌落培养物中分离质粒DNA。DNA测序由MCLAB执行。

用于经酵母展示的肽RTTTS和HTTS的结合亲和力测定

将50,000个经诱导的酵母细胞与各种浓度的FGFR1-Fc在含有1g/L BSA的磷酸盐缓冲盐水(PBSA)中在室温下孵育。将细胞以足够大的体积孵育以避免配体耗竭，并进行足够长的时间(通常3至24小时)以达到平衡。在孵育的最后30分钟期间，将酵母细胞与鸡抗c-Myc(Invitrogen)在PBSA中的1:2500稀释液一起孵育。将酵母沉淀，洗涤，然后与二级抗体的1:200稀释液在冰上一起孵育10分钟，所述二级抗体为：针对FGFR1-Fc的抗人IgG-FITC(Sigma Aldrich)和针对抗c-myc的抗鸡-IgY-PE(Santa Cruz Biotechnology)。将酵母洗涤、沉淀并重悬于PBSA中，然后立即使用EMD Millipore Guava EasyCyte通过流式细胞术进行分析。使用FlowJo(v7.6.1)分析流式细胞术数据。将结合曲线作图，并使用GraphPadPrism 6获得K

实施例3：蛋白水解稳定的成纤维细胞生长因子的表征

摘要

蛋白水解稳定性可以在提高不稳定生长因子(诸如FGF1)的功效中发挥重要作用。研究已经表明，FGF1在培养物中迅速降解，部分原因是血清中发现的或由细胞表达的蛋白酶。在实施例2中，描述了用于增加蛋白水解稳定性的FGF1工程化。筛选了FGF1随机诱变文库中表现出在酵母表面上增强的蛋白水解稳定性的FGF1突变体。在该实施例中，描述了可溶性FGF1的重组表达和对通过高通量筛选鉴定出的突变进行表征以改善FGF1中的蛋白水解稳定性。使FGF1和FGF2在大肠杆菌表达系统中重组表达和纯化。已证实与野生型FGF1相比，FGF1 BS4M1(D28N，L131R)和L131R突变体在蛋白水解方面更稳定，并且FGF1 L131R突变体可作为有效的FGF途径拮抗剂。

简介

FGF1是用于诱导血管生成的有效调控分子，但其不良的稳定性限制了其维持蛋白活性和实现延长的功效的能力。在实施例2中，描述了使用高通量筛选来选择在与纤溶酶一起孵育时表现出增加的蛋白水解稳定性的FGF1突变体，纤溶酶是一种在疾病的用于ECM降解的区域中发现的重要蛋白酶。在四种种类的FGF1文库后达成了完全共识，并确定了FGF1BS4M1(D28N、L131R)突变体。在蛋白质区域中发现了突变，所述突变据报道对于FGF的稳定性很重要。

在该实施例中，描述了来源于在筛选中鉴定出的FGF1 BS4M1突变体的突变体FGF的可溶性表达和表征。从酵母展示载体克隆野生型和FGF1 BS4M1突变体，并插入大肠杆菌表达载体中。在纯化后，通过检测与经酵母展示的FGFR3构建体的特异性结合来测试重组FGF1的正确折叠。

对于FGF1 BS4M1突变体和野生型FGF1，它们的可溶稳定性和它们调节FGF途径的能力得到了进一步表征。测试了蛋白在纤溶酶或胰蛋白酶中的蛋白水解稳定性，并使用蛋白质印迹法和条带强度定量测量了它们在不同时间点的降解程度。探讨了突变D28N和L131R的意义和它们对蛋白质稳定性的贡献。测量FGF1的热稳定性以分析它们与蛋白水解稳定性的关系。为了测试FGF1在更多生物学相关条件下的稳定性，对它们在MDA-MB-231乳腺癌细胞培养物中的降解程度进行了表征。此外，还进行了NIH3T3细胞中的ERK磷酸化测定，以表征调节FGFR活化下游的信号传导分子(诸如ERK)的活化的能力。来自这些表征研究的结果表明了经工程化的FGF1突变体的蛋白水解稳定性和拮抗活性得到了改善，并且它们有潜力用于抗血管生成疗法。

结果

FGF的重组表达

为了使经工程化的FGF1突变体以它们的可溶性形式表达并将它们与野生型蛋白进行比较，将这些蛋白在大肠杆菌表达系统中重组表达。将FGF1和FGF1突变体克隆到pBAD载体中，以在细胞内表达重组蛋白。将pBAD FGF1表达载体转化到大肠杆菌菌株Rosetta中，该菌株利用大肠杆菌中很少使用的密码子来增强真核蛋白的表达。使用基于洗涤剂的溶液裂解细胞。然后使用Ni-NTA柱色谱法和尺寸排阻色谱法纯化蛋白质。通过考马斯染色的蛋白质凝胶和蛋白质印迹法证实野生型FGF1的身份和纯度(图20A)。通过观察到与经酵母展示的FGFR3构建体的特异性结合，证实了FGF1的正确折叠(图20B)。

FGF1突变体BS4M1在纤溶酶中的蛋白水解稳定性

为了测量野生型FGF1和FGF1突变体BS4M1(D28N/L131R)的蛋白水解稳定性，将100ng可溶性FGF在纤溶酶中孵育各种孵育时间。然后，通过在蛋白质印迹法上运行样品并对抗FGF染色来评估它们的降解速率。通过测量每种条件下的条带强度，并通过未进行纤溶酶孵育的蛋白质的条带强度进行归一化，来计算剩余FGF的量。发现与野生型FGF1相比，BS4M1(D28N、L131R)突变体在纤溶酶中在所有孵育时间点均表现出较低的降解水平(图21)。因此，证实了用于增加FGF1针对纤溶酶的蛋白水解稳定性的筛选是成功的。

将来自BS4M1的突变(D28N和L131R)整合到稳定化的PM2(Q40P、S47I、H93G)突变体中，以创建PM3(D28N、Q40P、S47I、H93G、L131R)。测量了在48小时孵育后，每种构建体在不同纤溶酶浓度下的降解。发现将来自BS4M1的突变引入到来自PM2的突变导致在所有测试浓度下蛋白水解降解抗性显著增加(图22)。因此，得出的结论是，当与来自PM2的突变组合时，在BS4M1中新鉴定出的突变对蛋白水解稳定性具有加性效应。

工程化的FGF突变体在胰蛋白酶中的蛋白水解稳定性

以类似的方式在胰蛋白酶中测量野生型FGF1和FGF1突变体BS4M1的蛋白水解稳定性。假设用于针对纤溶酶的蛋白水解稳定性的工程化可以增加胰蛋白酶中的蛋白水解稳定性，因为纤溶酶和胰蛋白酶共享赖氨酸和精氨酸相同主要特异性。另外，证实了对胰蛋白酶降解更具抗性的FGF1突变体PM2(Q40P、S47I、H93G)也对纤溶酶切割更具抗性。结果发现，与野生型FGF1相比，BS4M1(D28N、L131R)突变体在胰蛋白酶中在所有孵育时间点均表现出较低的降解水平(图23)。因此，得出的结论是，用于FGF1在纤溶酶中的蛋白水解稳定性的工程化也成功地提高了胰蛋白酶中的蛋白水解稳定性。

FGF1突变体BS4M1中突变的意义

为了确定D28N和L131R突变对于将蛋白水解稳定性赋予给BS4M1突变体是否重要，创建了仅具有D28N或L131R突变的FGF1形式。通过评估这些突变体在纤溶酶中随时间推移的降解速率，测量了这些突变体的蛋白水解稳定性。发现与BS4M1(D28N/L131R)突变体相比，L131R突变体表现出相当的蛋白水解稳定性，但是与野生型FGF1相比，D28N突变体表现出甚至低得多的蛋白水解稳定性(图24)。得出的结论是，当掺入可溶性表达的蛋白中时，D28N突变不会转化成显著增加FGF1的蛋白水解稳定性。因此，继续进行L131R突变体的进一步表征。

还想确定在131位突变成精氨酸对于赋予蛋白水解稳定性而言是否是唯一的，或者除去亮氨酸的突变是否重要。因此，将131位可替代地突变为丙氨酸(L131A)或赖氨酸(L131K)，以查看这些单一突变体维持还是失去了其蛋白水解稳定性的增强。在纤溶酶中评估了它们的降解速率；发现与L131R相比，L131K保持了相似的降解水平，而与野生型FGF1相比，L131A表现出了更高的降解水平(图25)。

野生型FGF1和FGF1 L131R突变体的热稳定性

为了确定FGF1 L131R突变体的蛋白水解稳定性改善是否归因于热稳定性改善，测量了野生型FGF1和FGF L131R突变体的解链温度。使用ThermoFluor测定和疏水性染料来测量随着温度逐渐升高，每种蛋白质的解折叠

FGF1 L131R突变体在细胞培养物中的稳定性

在含有MDA-MB-231(一种表达尿激酶纤溶酶原活化物(uPA)以活化纤溶酶原并将其转化为纤溶酶的乳腺癌细胞系)的培养物中测试FGF1 L131R突变体的稳定性。将500ng蛋白质与MDA-MB-231一起在培养物中孵育各种孵育时间。浓缩每种条件下的所有蛋白质，并将每种条件上样到单独的孔中以通过蛋白质印迹法进行分析。通过测量条带强度并用未在培养物中孵育的500ng蛋白质进行归一化，来对剩余蛋白质的量进行定量。发现与野生型蛋白相比，FGF1 L131R突变体在培养物中表现出增加的稳定性(图27)。

FGF1 L131R突变体是FGFR拮抗剂

为了表征FGF1 L131R调节FGF途径的能力，评估了其调节ERK磷酸化(MAPK)的能力，ERK是一种在FGFR活化的下游并且对诱导细胞增殖很重要的关键信号传导分子

FGF1 L131R突变体与NIH3T3细胞的结合

表征FGF1 L131R突变体的结合亲和力，并将其与野生型FGF1的结合亲和力进行比较。将表达FGFR的NIH3T3细胞与不同浓度的FGF1一起在4℃孵育，以防止孵育。用荧光标记的抗His抗体标记细胞，以检测结合的His标记的FGF1。发现FGF1 WT和FGF1 L131R突变体两者均表现出对NIH3T3细胞的10nM结合亲和力(图30)。

讨论

在该实施例中，对来自实施例2的用于纤溶酶中的蛋白水解稳定性的筛选中鉴定出的FGF突变体进行了可溶性表达和表征。重组表达时，发现FGF1易于表达和纯化。然而，发现表达的产率相当低，为1-3mg/L表达。这种低蛋白质产率可能是由于FGF1的不良稳定性所致。

成功地证实了与野生型FGF1相比，可溶性FGF1 BS4M1(D28N、L131R)突变体在纤溶酶中显示出增加的蛋白水解稳定性。当突变D28N和L131R与来自Zakrzewska等人

通过表征FGF1 D28N和L131R单突变体，发现大多数增加的蛋白水解稳定性归因于L131R，而D28N单突变体的蛋白水解稳定性甚至低于野生型。经酵母展示的FGF1与可溶性大肠杆菌来源的FGF1之间的D28N突变的显著性差异可能归因于仅在经酵母展示的蛋白中发生的糖基化。天冬氨酸突变为天冬酰胺导致真核生物引入了NGx糖基化位点

L131R突变是违反直觉的突变，因为纤溶酶具有对精氨酸的主要特异性。实际上，没有合理的设计策略会涉及将新的潜在切割位点引入蛋白质。然而，如实施例1中所讨论的那样，主要特异性不是潜在切割位点是否发生蛋白切割的唯一决定因素；该位点周围的多个氨基酸以及对于蛋白酶而言该位点的空间可及性也起很大贡献。为了进一步探究除去亮氨酸的突变或在131位处突变成精氨酸对于增加蛋白水解稳定性是否重要，对FGF1 L131A和L131K单突变体进行了表征。已经发现，通过合理设计将亮氨酸131改变为丙氨酸(通常用于蛋白酶切割位点的取代的氨基酸)，导致甚至与野生型FGF1相比，蛋白水解稳定性降低。然而，亮氨酸131突变为赖氨酸(纤溶酶具有主要特异性的另一种氨基酸)导致在纤溶酶中保留增加的蛋白水解稳定性。虽然考虑了纤溶酶对FGF1蛋白的131位处的切割是否导致所产生的蛋白片段的蛋白水解稳定性提高，但得出的结论是筛选不能针对这种突变进行选择。经酵母展示的FGF1内的任何切割都将导致c-myc信号的丢失以及除去该突变体的选择。由于赖氨酸和精氨酸都是带正电荷的氨基酸，因此可能替代的是向该位置添加正电荷可能对增加FGF1的蛋白水解稳定性很重要。发现野生型FGF1与FGF1 L131R突变体之间的解链温度没有统计学上显著的差异，表明热稳定性的提高不能解释蛋白水解稳定性的提高。因此，需要进一步研究来确定性地发现L131R增加蛋白水解稳定性的机制。

还发现在含有MDA-MB-231乳腺癌细胞的细胞培养物中，FGF1 L131R突变体似乎比野生型FGF1更稳定。这些细胞表达尿激酶纤溶酶原活化物(uPA)，所述uPA将纤溶酶原切割并活化成纤溶酶。该结果对于证明FGF1L131R突变体在更生物学相关的背景下表现出增加的稳定性具有重要意义。

最后，在NIH3T3细胞中使用ERK磷酸化测定，发现L131R突变将FGF1转变为FGF途径拮抗剂。鉴于增加蛋白水解稳定性的筛选仅选择与FGFR结合的突变体，而不选择蛋白质是充当激动剂还是拮抗剂，该结果在合理的同时很令人感兴趣。FGF1 L131R突变体对NIH3T3细胞的结合亲和力与野生型FGF1大致等同，这解释了为什么FGF1 L131R突变体的IC50与抑制测定中使用的野生型FGF1的浓度大致等摩尔。FGF1 L131R突变体对ERK磷酸化的抑制作用不完全，因为在野生型FGF1存在的情况下用最高浓度的FGF L13R突变体处理过的样品显示出低ERK磷酸化水平，该低ERK磷酸化水平高于未处理的细胞的ERK磷酸化水平。然而，在FGF1 R50E突变体中也观察到了这种现象，这是唯一其他在文献中报道为起拮抗剂作用的FGF1突变体

总之，在该实施例2和实施例3中描述的结果表明，能够成功地利用高通量筛选来增加FGF1在纤溶酶中的蛋白水解稳定性，并鉴定出用于FGF2的关键蛋白水解稳定的候选物。结果表明，FGF1突变体表现出增加的在纤溶酶和胰蛋白酶中的蛋白水解稳定性，和增加的在培养物中的稳定性。结果证明，FGF1 L131R突变体充当有效的FGF途径拮抗剂，所述有效的FGF途径拮抗剂可用于抑制NIH3T3细胞中FGF1诱导的ERK磷酸化。FGF1突变体显示出它们有望开发出一种蛋白水解稳定的治疗分子用于抗血管生成疗法，以治疗诸如癌症和眼睛中不希望的血管新生的疾病。

材料和方法

重组FGF1表达与纯化

使用Rosetta(DE3)感受态细胞(Novagen)表达FGF1。将基因从人FGF1cDNA(Dharmacon)克隆到具有N末端6x His标签和阿拉伯糖诱导型启动子的pBAD/His B载体(Invitrogen)中。将限制性位点XhoI和HindIII用于克隆。将pBAD FGF1-His质粒转化到化学感受态Rosetta(DE3)细胞中，在37℃下使用235rpm振荡在1mL LB中回收，并接种在具有氨苄青霉素(Amp)选择的LB板上。将菌落接种到5mL LB Amp中，并在37℃下生长过夜。将1mL过夜培养物用于接种100mL LB Amp表达培养物。在37℃下使用235rpm振荡使细胞生长2至2.5小时。在为约0.5的OD600时，用0.2％L-阿拉伯糖(Sigma Aldrich)诱导细胞。使蛋白质表达并维持在细胞质中。使表达培养物在37℃下生长6小时，然后将细胞离心沉淀并收集。

用溶菌酶、DNA酶I和硫酸肝素在B-PER细菌蛋白提取试剂(Thermo Scientific)中裂解细胞30分钟。将提取混合物以15,000g离心沉淀10分钟，收集上清液并滤过0.22μm过滤器。如在第2.5.6.1节中所详述，将含有FGF1的上清液以1:10稀释用结合缓冲液稀释以进行Ni-NTA亲和力纯化。将上清液和结合缓冲液的混合物上样到Ni-NTA柱上。浓缩来自Ni-NTA亲和纯化的洗脱液，并使用截断值为10kDa的Amicon Ultra-4离心过滤器而缓冲液交换到PBS中。如第2.5.6.1节中所述，使用采用Superdex 75柱的尺寸排阻色谱法纯化最终的FGF1-His蛋白。

FGF1单突变体的克隆

使用重叠延伸PCR将野生型FGF1突变为单氨基酸突变体

蛋白水解稳定性测定

对于每种条件，将125ng蛋白质在20μL纤溶酶消化缓冲液(100mM Tris-HCl、0.01％BSA，pH 8.5)中在37℃下与不同浓度的纤溶酶一起孵育，或达不同的孵育时间。在每个样品的适当孵育时间结束时，通过将样品在-20℃下储存来停止蛋白酶消化。所有孵育结束后，将样品在冰上解冻以进行分析。将每个20μL样品与5μL NuPAGE LDS样品缓冲液和2μLNuPAGE样品还原剂混合。将样品加热到95℃达10分钟，然后运行SDS-PAGE凝胶。将凝胶与20％乙醇一起孵育10分钟，然后使用Invitrogen iBlot凝胶转移设备(程序0，7分钟)将其印迹到硝酸纤维素膜上。

将蛋白质印迹法用5％脱脂奶粉(Bio-Rad)在TBST(137mM NaCl、2.7mM KCl、25mMTris、0.1％Tween 20)中的溶液封闭1小时。初步染色是用小鼠抗FGF1(Sigma Aldrich，克隆2E12)在5％奶的TBST溶液中的1:1000稀释液进行1小时。在TBST中洗涤3次，每次15分钟后，用山羊抗小鼠HRP(ThermoFisher Scientific)的1:2500稀释液进行二次染色2小时。在TBST中再洗涤3次，每次15分钟后，通过BioRad ChemiDoc XRS系统以Chemi HiSensitivity模式对印迹进行成像。使用ImageJ量化条带强度，并使用GraphPad Prism 6对归一化的条带强度进行作图。

用于测量解链温度的ThermoFluor测定

将50μL的1.2mg/mL蛋白质加载到96孔薄壁PCR板(Bio-Rad)中。将0.5μL SYPROOrange(Molecular Probes)添加到样品中并彻底混合。将板用塑料盖密封，然后用BioRadCFX96 RT System C1000 Touch进行板分析。将板冷却至4℃达5分钟，然后将板以1℃/分钟的速率缓慢加热至100℃。在每个℃下监测和测量荧光变化。在Microsoft Excel上绘制荧光随温度变化的曲线，并通过找到荧光等于最大荧光信号和最小荧光信号的平均值的温度来计算解链温度。

细胞培养物稳定性测定

将MDA-MB-231细胞以100,000个细胞/孔的密度接种在6孔板(Sigma Aldrich)上含10％胎牛血清(FBS)(Gibco)的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)(Gibco)中，并且在37℃下于5％CO

将蛋白质印迹法用5％脱脂奶粉(Bio-Rad)在TBST(137mM NaCl、2.7mM KCl、25mMTris、0.1％Tween 20)中的溶液封闭1小时。初步染色是用小鼠抗FGF1(Sigma Aldrich，克隆2E12)在5％奶的TBST溶液中的1:1000稀释液进行1小时。在TBST中洗涤3次，每次15分钟后，用山羊抗小鼠HRP(ThermoFisher Scientific)的1:2500稀释液进行二次染色2小时。在TBST中再洗涤3次，每次15分钟后，通过BioRad ChemiDoc XRS系统以Chemi HiSensitivity模式对印迹进行成像。使用ImageJ量化条带强度，并使用GraphPad Prism 6对归一化的条带强度进行作图。

NIH3T3 ERK磷酸化测定

将MDA-MB-231细胞以100,000个细胞/孔的密度接种在6孔板(Sigma Aldrich)上含10％新生小牛血清(NBCS)(Gibco)的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)(Gibco)中，并且在37℃下于5％CO

将蛋白质印迹法用5％脱脂奶粉(Bio-Rad)在TBST(137mM NaCl、2.7mM KCl、25mMTris、0.1％Tween 20)中的溶液封闭1小时。初步染色是用兔抗磷酸-ERK1/2(Y202/Y204)抗体(Cell Signaling)或兔抗ERK1/2(Cell Signaling)在5％奶的TBST溶液中的1:1000稀释液进行1小时。在TBST中洗涤3次，每次15分钟后，用山羊抗兔HRP(Santa CruzBiotechnology)的1:2500稀释液进行二次染色2小时。在TBST中再洗涤3次，每次15分钟后，通过BioRad ChemiDoc XRS系统以Chemi Hi Sensitivity模式对印迹进行成像。使用ImageJ量化条带强度，并使用GraphPad Prism 6进行作图。

NIH3T3细胞结合测定

将NIH3T3细胞与不同浓度的野生型FGF1或FGF1 BS4M1突变体一起在结合缓冲液(含有1mM的MgCl

实施例1至实施例3中引用的参考文献

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实施例4：NK1的蛋白质工程化

1.1通过酵母表面展示进行NK1的蛋白质工程化。酵母表面展示是一种功能强大的定向进化技术，其已被用于工程化蛋白质，以实现增强的结合亲和力、正确折叠和提高的稳定性。通过与酵母接合凝集素蛋白Aga2p的遗传融合，在酵母菌株酿酒酵母的表面上展示NK1蛋白的组合文库。Aga2p以二硫键与Aga1p结合，后者与酵母细胞壁共价连接。与大多数酵母展示研究不同，在此使用的构建体将展示的NK1蛋白系留至Aga2p的N末端(来自美国专利第9,556,248号的图2)。对于该配体-受体系统，发现该取向降低了下文描述的受体和抗体标记的空间局限。NK1蛋白侧接N末端血凝素(HA)和C末端c-myc表位标签，其用于确认构建体在酵母细胞表面上的表达并定量表面表达水平。使用在展示的NK1蛋白的C末端处的柔性(Gly

通常创建10

1.2概述：使用酵母表面展示指导NK1的进化以实现高亲和力和稳定性。对NK1片段进行工程化，以实现1)增强的热稳定性和2)对Met的高结合亲和力。第一轮定向进化主要由进化NK1组成，以在酵母细胞表面上进行功能性表达并实现Met结合亲和力的适度改善。将合并的产物进一步诱变，并进行第二轮定向进化，在所述第二轮定向进化中针对提高的Met结合亲和力或增强的稳定性对它们进行独立筛选。然后通过对来自第二轮的合并产物执行DNA改组，然后同时针对提高的Met结合亲和力和增强的稳定性进行筛选，来进行第三轮定向进化(图3)。

1.3野生型NK1不在酵母细胞表面上功能性表达。HGF以两种主要的同种型，即同种型1(I1：Genbank登录号NP_000592)和同种型3(I3：Genbank登录号NP_001010932；SEQ IDNO:10)存在。

HGF I1和I3的序列相同，除了在I3的第一Kringle结构域(K1)中有5个氨基酸缺失。使用酵母展示质粒pTMY-HA来在酵母细胞表面上表达NK1 I1或NK1 I3，作为与酵母细胞壁蛋白Aga2p的遗传融合(图2)。对于NK1 I1和NK1 I3两者发现了相似的结果。针对相对表达(通过HA标签的抗体检测)和与20nM或200nM的用Alexa 488标记的Met-Fc(R&D Systems)的结合对经酵母展示的NK1 I1进行染色。由于野生型NK1-Met相互作用需要肝素，因此在存在(来自美国专利第9,556,248号的图4A顶部)和不存在(图4A，底部)2μM肝素(Lovenox,Sanofi-Aventis)的情况下进行该实验。使用流式细胞术检测在酵母细胞表面上表达NK1I1的酵母。仅观察到与可溶性Met-Fc的低水平结合(图4，x轴与y轴)。示出了在将经酵母展示的NK1加热至70℃后的结合水平(来自美国专利第9,556,248号的图4B)。如下所示，由酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)产生的可溶性NK1 I1在60℃下完全解折叠(来自美国专利第9,556,248号的图4)。总的来说，该数据表明经酵母展示的野生型NK1不在酵母细胞表面上进行功能性表达。

1.4使用酵母表面展示工程化NK1以实现提高的亲和力和稳定性。使用三轮分开的定向进化来进化NK1以实现与野生型NK1相比稳定性和Met结合亲和力的改善。由于NK1不在酵母细胞表面上进行功能性表达，因此第一轮定向进化主要由筛选经酵母展示的NK1突变体以分离与Met受体结合的克隆组成。为了实现这个目标，使用核苷酸类似物8-氧代-dGTP和dPTP(TriLink BioTechnologies)通过易错PCR生成了约3×10

酵母偏好在30℃下生长，然而，它们往往在20℃下显示出更复杂蛋白质的改善表达。因此，在20℃诱导酵母细胞表面上的蛋白质表达之后进行两轮文库分选，以实现改善的NK1突变体折叠，并且使用FACS来分离出表现出可检测的与200nM Alexa-488标记的Met-Fc(Met-Fc A488)的结合的酵母细胞(来自美国专利第9,556,248号的图5A)。随后的文库分类是使用20℃或30℃诱导温度并行进行的，目的是使用30℃的表达温度筛选具有提高的稳定性的突变体。在以每种策略进行五轮分选(使用20℃的表达温度进行5轮，或使用20℃进行2轮，然后使用30℃的表达温度进行3轮)后，该文库清楚地包含与200nM Met-Fc结合的成员。

对于第二轮定向进化，通过易错PCR对来自第一轮定向进化的最终种类的合并突变体进行随机突变，以生成约8×10

最后，第三轮定向进化由来自第二轮定向进化的稳定性和亲和力增强的突变体的最终库的DNA改组组成，以生成约2×10

鉴定出NK1变体库，其中所述变体在提高的温度下在酵母细胞表面上有效表达，并且即使在存在过量HGF竞争物的情况下进行2天解结合步骤后，也保持与2nM可溶性Met的持久结合(来自美国专利第9,556,248号的图6)。

1.5亲和力和稳定性增强的NK1突变体的序列分析。与执行第3轮定向进化并行，开始对来自第2轮的有希望的突变体进行表征。针对每种分选策略(20℃亲和力分选策略和37℃稳定性分选策略)对来自最后两个分选轮次中的每一分选轮次的8个随机突变体进行测序。有趣的是，测序的所有32个克隆均基于NK1 I1，即使初始文库的测序表明NK1同种型1和同种型3的比例相对相等也如此。此外，许多有利的或一致的突变是明显的。从文库分选产物中随机测序的克隆中重复出现10个突变，并且这些突变中的8个突变出现在超过一半的随机选择的克隆中。这些显性突变在表1中以粗体突出显示。由于突变种类繁多，因此没有一个单独的克隆包含这些突变中的所有8个突变。然而，一个克隆包含八个最常见突变中的五个(K62E、N127D、K137R、K170E、N193D；此克隆称为M2.1)。将其余三个突变(Q95R、K132N、Q173R)添加到此克隆的背景上，以生成称为M2.2的NK1突变体。这些突变的进一步序列分析突出显示了许多令人感兴趣的观察发现，所述令人感兴趣的观察发现在下面进一步讨论。

来自两种策略的分选产物没有产生许多完全相同的克隆，而是表现出在共有序列中的显著重叠。在M2(第二轮定向进化)产物中观察到的I125T与N127D之间的负相关性在M3(第三轮定向进化)产物中持续存在。在30个经测序的克隆中，有25个包含N127D突变，所述克隆中没有一个还包含I125T突变。然而，不包含N127D的五个克隆中的每个克隆均包含I125T突变。K62E/V64A和I130V/K132N共有突变以仅2个氨基酸间隔发生。

来自M2产物的所有八个共有突变都存在于M3产物中(回想M2.2＝K62E、Q95R、N127D、K132N、K137R、K170E、Q173R、N193D)。超过50％的M3产物中出现了五个附加共有突变：V64A、N77S、I130V、S154A和F190Y。

表7：在某些变体中存在的序列取代

实施例5：NK1的产生

2.1在酵母菌株巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中野生型NK1和NK1突变体的可溶性产生。简而言之，将编码含有N末端FLAG表位标签(DYKDDDDK)和C末端六组氨酸标签的野生型NK1、M2.1或M2.2的DNA克隆到分泌质粒pPIC9K中。将构建体转化到巴斯德毕赤酵母中，并进行在含有4mg/mL遗传霉素的YPD琼脂平板上生长的选择，并通过培养物上清液的蛋白质印迹法筛选NK1表达。图7A(来自美国专利第9,556,248号)示出M2.1和M2.2在30℃良好表达，而野生型NK1以低得多的水平表达。该数据与先前的研究一致，先前的研究报告了使用酵母表面展示工程化以实现增强的蛋白质稳定性，也赋予了提高的重组表达水平。然而，将表达温度降低至20℃使得能够有效表达野生型NK1(数据未示出)。在摇瓶培养中将NK1和突变体表达放大至0.5L，并使用固定化的镍亲和色谱法纯化，然后在Superdex

2.2突变体M2.1和M2.2表现出比野生型NK1更高的热稳定性。为了测试热稳定性，在酵母细胞表面上表达M2.1和M2.2，加热至不同的温度，并通过流式细胞术测量与荧光标记的Met-Fc的结合的保留(来自美国专利第9,556,248号的图8A)。NK1突变体M2.1和M2.2在酵母表面上的T

为了测试可溶性蛋白质的稳定性，在Jasco J-815 CD光谱仪上使用圆二色性(CD)监测纯化的可溶性突变体的二级结构解折叠。突变蛋白的CD扫描在208nm处确定了峰，这在很大程度上归因于β薄片结构元件。M2.1和M2.2的CD扫描与野生型NK1相似，说明突变蛋白含有与野生型NK1相同的总体二级结构元件(来自美国专利第9,556,248号的图8B)。野生型NK1在80℃时的CD光谱类似于随机线圈的CD光谱，表明具有使用圆二色性监测二级结构元件的解折叠的能力(图8B)。使用此信息，可以通过可变温度CD扫描来监测此二级结构的解折叠(图8C)。在这些测定中的每一个测定中，与野生型NK1(T

表8.

2.3盐浓度对蛋白质稳定性的影响。为保持其结构完整性，已观察到野生型NK1必须保持在含有高盐浓度(>200-300mM NaCl)的缓冲液中。作为此要求的进一步证据，野生型NK1在使用含有中等盐浓度(137mM)的缓冲液的尺寸排阻色谱上显示了较宽的延迟洗脱分布(来自美国专利第9,556,248号的图9和插图)，表明了在这些条件下的解折叠和/或与柱的非特异性结合。相比之下，在类似的中等盐条件下，M2.1和M2.2在尺寸排阻色谱上洗脱为单个尖锐的峰(来自美国专利第9,556,248号的图9)。

实施例6：NK1的表征

3.1 NK1同二聚化界面上的点突变残基N127位于连接N结构域和K1结构域的接头区域内(图1)。该天冬酰胺残基的侧链形成两个氢键。在文库分离的变体中经常观察到N127D变体。(表2和表3)。为了探究M2.2中N127D突变对生物活性的影响，在该位置生成了一系列点突变体。丙氨酸残基通过破坏NK1同二聚体的稳定化相互作用而将野生型NK1从激动剂转变为拮抗剂。测试了该位置突变为赖氨酸或精氨酸的影响。这些取代通过庞大的带电侧链引入了空间和静电障碍。

另外，分析了点突变体D127N；这会将这个位置还原回野生型天冬酰胺残基。在包含N127D突变的M2.2的上下文中，这些突变称为D127A、D127K、D127R和D127N。重要的是，这些突变体中的每一个突变体均保留了与M2.2相关联的高热稳定性(表5)。

3.2 NK1突变体作为Met受体激动剂或拮抗剂的表征。在MDCK细胞分散(cellscatter)和uPA测定中评估NK 1突变体，MDCK细胞分散和uPA测定是两种广泛用于研究哺乳动物细胞中Met受体活化的测定。对于MDCK细胞分散测定，将1500个细胞/孔接种到96孔板中的100μL完全生长培养基中，并在37℃、5％CO

对于MDCK uPA测定，将4000个细胞/孔接种到96孔板中的100μL完全生长培养基中，并在37℃、5％CO

突变体M2.2 D127A、D127K和D127R不诱导Met活化，如通过MDCK细胞的分散(来自美国专利第9,556,248号的图10和图11A)或MDCK细胞中的uPA活化(图11B)而测量的。包含N127D突变的未修饰的M2.2变体表现出弱的活性(来自美国专利第9,556,248号的图11A)或无激动活性(来自美国专利第9,556,248号的图10和图11B)。

相比之下，将127位恢复为野生型天冬酰胺残基(M2.2 D127N)导致了MDCK分散(来自美国专利第9,556,248号的图10和图11A)和uPA测定(来自美国专利第9,556,248号的图11B)两方面的激动活性。M2.2 D127N的活性与野生型NK1的活性相似，并且在可溶性肝素存在下均显示出增强的活性(来自美国专利第9,556,248号的图11C的顶部对比底部)。相比之下，在存在或不存在肝素的情况下，M2.2D127A、D127K和D127R在这些测定中均未表现出激动活性(来自美国专利第9,556,248号的图10和图11A至图11C)。

测试了这些突变体抑制HGF诱导的Met活化的能力。作为对照，M2.2D127N不抑制HGF诱导的活性，从而提供了其作为Met受体激动剂的功能的进一步证据(来自美国专利第9,556,248号的图12)。在不存在可溶性肝素的情况下，M2.2突变体D127A、D127K和D127R表现出对HGF诱导的MDCK分散的弱或最小抑制(来自美国专利第9,556,248号的图12顶部)

相比之下，加入2μM肝素时观察到了强拮抗活性(图12底部)。预先配制具有2:1的摩尔比的肝素:NK1的NK1突变体足以赋予这种拮抗活性，并且消除了添加过量肝素以改善拮抗活性的需要(来自美国专利第9,556,248号的图13)。未修饰的M2.2(M2.2 N127D)在使用2:1摩尔比的肝素时仅表现出较弱的拮抗活性(来自美国专利第9,556,248号的图13)，支持了合理设计的点突变的实用性。M2.2 D127K的拮抗活性类似于先前报道的拮抗剂NK1N127A的拮抗活性(来自美国专利第9,556,248号的图13)。然而，与NK1 N127A相比，M2.2D127A/K/和R突变体具有显著改善的稳定性和表达，即更低的盐依赖性稳定性、为约15℃的增加的T

4.1重组Aras-4的生化和生物学表征。基于来自第三轮定向进化的克隆中的五个克隆的序列分布、酵母表面表达水平和Met-Fc结合，对所述克隆进行选择以供进一步研究。这些克隆被称为Aras-1、Aras-2、Aras-3、Aras-4和Aras-5(来自美国专利第9,556,248号的图14)。发现除了Aras-1以外，这些克隆中的每一个克隆都在酵母巴斯德毕赤酵母中良好表达。

选择Aras-4进行进一步表征。如通过CD温度解链(T

4.2引入二硫键以形成共价结合的二聚体。将游离的半胱氨酸残基引入M2.2D127N的N末端，这导致重组表达时形成单体和二聚体物质。使用尺寸排阻色谱法从单体中纯化胱氨酸连接的二聚体蛋白(称为cdD127N)。在还原和非还原条件下对cdD127N的SDS-PAGE分析证实，二聚体是通过共价二硫键形成的。(来自美国专利第9,556,248号的图16)。还生成了胱氨酸连接的二聚体M2.2 D127K(称为cdD127K)和Aras-4(称为cdAras-4)多肽。

4.3 cdD127N、cdD127K和cdAras-4的生物活性。cdD127N和cdD127K表现出与具有与野生型NK1相似的激动活性的M2.2 D127N单体相比处于浓度更低的数量级的激动活性(来自美国专利第9,556,248号的图17)。cdD127K的激动剂活性令人惊讶，因为亲代单体M2.2 D127K是拮抗剂。同样令人惊讶的是cdAras-4的结果，其中共价键将拮抗剂Aras-4转化为激动剂。观察到的激动活性水平接近全长HGF，然而cdD127N、cdD127K和cdAras-4相对于全长HGF具有显著改善的稳定性，并且可以在酵母中重组表达。

4.4仅N末端半胱氨酸直接介导同二聚化。基于NK1同二聚体的晶体结构，认识到127位在相邻的启动子上非常接近。这表明了通过将半胱氨酸残基置于该位置来形成共价连接的同二聚体的可能性。为了测试这种可能性，生成了变体Aras-4多肽，其中残基D127用Cys取代。如图18(来自美国专利第9,556,248号)所示，所得的多肽自发地或在菲咯啉-硫酸铜处理后基本上不能产生二聚体。

除了通过在NK1及其变体的N末端添加游离半胱氨酸来进行共价连接外，还测试了其他位置和接头。(来自美国专利第9,556,248号的图19)。游离半胱氨酸或游离半胱氨酸与半胱氨酸标签的组合(Backer等人(2006)Nat.Med.13(4):504-509)附接至Aras-4变体的N末端或C末端。在酵母中重组表达时，仅在N末端的游离半胱氨酸产生了二聚体蛋白。

5.0含有肝素海藻酸盐微丸的HGF变异多肽的制备。海藻酸钙微丸由于增强的活性保留和延长的储存时间而可为HGF提供稳定的平台，并且因此可用作用于受控HGF变体释放的装置。肝素-琼脂糖珠粒(Pharmacia LKB)可以在紫外光下灭菌30分钟，然后与经过滤灭菌的海藻酸钠混合。然后可以将混合的浆液通过针头滴入装有CaCl

实施例7：使用HGF/FGF组合进行角膜治疗

尽管其作为眼睛的圆顶状、最外组织的保护作用，但通常透明的角膜作为损伤或疾病的结果而极易发生溃疡、瘢痕形成和浑浊化。在严重的角膜损伤和疾病中，尽管有许多但主要是支持性的措施是当前可用的，但经常会接着发生永久性瘢痕形成和视力丧失。

如图39中所总结，已经证明，在透明质酸(HA)和硫酸软骨素(CS)的粘弹性凝胶载体内递送的骨髓源性MSC的分泌组每天仅施加一次即可加速上皮创伤愈合并防止大鼠角膜碱灼伤后的血管新生和瘢痕形成。

该实施例表明，在碱灼伤后，单独的这种经工程化的HGF(eHGF)片段即可加速角膜中的上皮愈合(图39)。另外，已经执行了高通量筛选方法以开发FGF变体，所述FGF变体具有在细胞培养测定中作为FGF受体(FGFR)拮抗剂的有希望属性。FGFR拮抗剂可以抑制血管内皮生长因子(VEGF)介导的血管生成和转化生长因子(TGF)β介导的纤维化效应，所述效应已知由FGF进行上游调节。

这种联合疗法具有用于(1)持续性角膜上皮缺损(PCED)和(2)角膜血管新生的潜力。PCED是等同于足部的不愈合(例如糖尿病性)溃疡的眼病。当上皮愈合和缺损闭合的过程延迟时，会发生PCED，从而导致角膜上皮缺损，所述角膜上皮缺损可导致溃疡、感染、瘢痕形成、穿孔和视力丧失。单独的eHGF分子具有解决PCED的潜力，其中唯一目标是闭合上皮糜烂、擦伤或溃疡。PCED可以是由损伤、先前的眼科手术、感染(例如先前的疱疹感染或严重的细菌性溃疡)或眼部疾病(包括潜在的病症，诸如严重的干眼症、糖尿病、由于眼睑病理学引起的慢性暴露，以及造血干细胞移植后的眼移植物抗宿主病)造成。据估计，干眼症和糖尿病占PCED病例的超过50％。

目前用于治愈PCED的治疗是次优的，其中临时手段由以下组成：润滑剂、绷带(接触镜、贴片和侵入性手术图(invasive surgical graphs))以及通过自体血清、羊膜和脐带液提供的内源性生长因子。然而，这些治疗可能无法以及时方式完全治愈角膜缺损。在糖尿病性角膜上皮病变中，由于糖尿病神经介入而存在角膜感觉降低。

对于eHGF和抗FGFR的组合，角膜血管新生是未满足的目标需求，基于马萨诸塞州眼和耳/哈佛医学院研究(Massachusetts Eye and Ear/Harvard Medical School study)中公布的4.14％发生率的推算，这每年影响估计140万患者。异常的角膜血管新生—没有用于其的经FDA批准的治疗—通常作为PCED的晚期或严重表现发生和/或作为经由创伤或疾病而导致的角膜外围上的上皮干细胞的损失或破坏发生。这方面的典型示例是化学角膜灼伤，这影响每100,000人中的10.7人(占所有眼部创伤的11.5％-22.1％)，其中外周干细胞被严重耗竭，从而导致延迟的愈合和到角膜上的血管生长。化学灼伤，尤其是碱灼伤，可论证地是眼睛遭受的最具破坏性的损伤，并且尽管目前所有(主要是支持性的)措施可用，但是其几乎无一例外地通过角膜和结膜的瘢痕化、角质化、浑浊化和血管新生而导致失明。因此，它是所建议的eHGF/抗FGFR联合疗法所靶向的多种途径以及所建立的动物模型的理想目标，在所述建立的动物模型中已证明它们的组合在抑制血管新生和纤维化的同时促进上皮形成(图40)。除角膜化学灼伤外，还有许多其他原因的角膜血管新生，所述角膜血管新生目前尚无治疗方法，但潜在地可通过eHGF/抗FGFR组合技术解决，所述角膜血管新生包括史蒂文斯-约翰逊综合征、角膜缘干细胞缺损，以及甚至接触镜过度配戴，所有这些在它们的核心都代表了透明的、无血管的角膜和与其相邻的高度血管化结膜组织之间的屏障的折衷。

动物

在这些实验中使用了7至8周龄的雌性野生型大鼠(Charles RiverLaboratories)。将大鼠麻醉并皮下施用0.5mg/kg的丁丙诺啡SR，并在其左眼中施用一滴0.5％的盐酸普罗卡因(proparacaine hydrochloride)，然后进行手术。

角膜损伤

碱灼伤损伤是通过向角膜中央区域施加4mm直径的1N NaOH饱和滤纸1分钟，然后用100mL无菌盐水溶液冲洗来执行的。

生长因子施用和角膜创伤修复的评估

在碱灼伤后，立即在白光和钴蓝光条件下拍摄角膜的照相图像。将荧光素染料施加至角膜表面，以评估钴蓝光下的上皮缺损区域。

将31只大鼠分成7个治疗组，每个治疗组4-5只大鼠。所述治疗组包括无菌盐水作为阴性对照、透明质酸凝胶(DisCoVisc)盐水(HA/CS)混合物、0.01％eHGF的盐水悬液、0.01％FGF-1拮抗剂的盐水悬液、0.02％eHGF-FGF-1拮抗剂的盐水悬液、0.02％eHGF-FGF-1拮抗剂的HA/CS凝胶和0.01％eHGF的盐水悬液，之后是1％醋酸泼尼松龙。在受伤当天照相后，向每只大鼠施用一次10μL的结膜下注射和一次20μL的适当物质的局部治疗。在每只大鼠中，结膜下治疗和局部治疗由相同的物质和浓度组成，但类固醇组的情况除外，其中结膜下注射为10μL的eHGF，并且局部治疗为20μL的eHGF，之后是20μL醋酸泼尼松龙。

每天拍摄照片，并每天施用一次局部治疗，共14天。损伤后第14天，拍摄最终照片，并对大鼠实施安乐死并执行摘出术。上皮缺损的面积是通过使用NIH ImageJ软件检查每日照片来计算的。使用照片评估角膜浑浊化和血管新生。

免疫组织化学

将整个眼球的冷冻切片固定。将切片免疫染色并用共聚焦显微镜检查。

RNA分离和实时qPCR

使用RNeasy Micro试剂盒分离总RNA。将分离的RNA逆转录成cDNA。使用用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、α平滑肌肌动蛋白的引物执行实时qPCR。分析结果并将其归一化为GAPDH。

在机械角膜损伤模型中表征和控制工程化的HGF的创伤愈合效应。将使用磷酸化测定来确认和阐明eHGF对原代培养的角膜上皮细胞的HGF受体的活性，就像以前对血管内皮细胞所做的一样。

优化限定联合疗法，以防止角膜碱灼伤模型中的瘢痕形成和血管新生。预计将抗纤维化剂与HGF的营养效应配对概括了MSC分泌组的再生效应。eHGF将与(a)工程化的FGFR拮抗剂，(b)抗VEGF剂贝伐单抗(bevacizumab)或(c)局部类固醇配对，以减少角膜碱灼伤后接着发生的基质纤维化和血管新生，与此同时还通过HGF介导的HGF受体活化促进上皮创伤愈合。将在有和没有将基于透明质酸的凝胶载体体内递送至碱灼伤的大鼠角膜的情况下，对这些对进行测试，并通过将它们与完整MSC分泌组的创伤愈合效应进行比较来滴定确定它们的相对比率。上皮和基质完整性和表型、角膜清晰度、血管新生和炎症的临床和组织学证据将用作治疗后的结局度量。

实施例7中引用的参考文献：

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