HEK293

摘要： 基因编码工具(例如CRISPR/Cas9)的出现使敲除哺乳动物细胞基因成为现实.然而,实现细胞的多基因敲除成功率低且所需时间长.细胞融合技术是构建杂合细胞的常用方法,通过融合两种不同表型的细胞,构建出一种具有杂合表型的新型细胞.但是,由于基因的互补作用,通过基因敲除而获得的性状在细胞融合后成为隐性性状,融合细胞不能表现该性状.本研究的目的是设计一种通过细胞融合技术和CRISPR/Cas9技术获得基因双敲除细胞的方法.由于现阶段没有关于HEK 293细胞株细胞融合的参考数据,所以首先在HEK 293野生型细胞株中分别敲除GPI生物合成必需的PIGA或PIGK,获得PIGA-KO细胞株和PIGK-KO细胞株,并以这两个细胞株作为模型进行条件优化.经过反应条件优化,HEK 293细胞的融合效率显著提高,且实现了FUT8敲除细胞株和ST6GALJ敲除细胞株的快速融合;其次是将细胞融合技术与CRISPR/Cas9技术结合从而实现多种糖基因的快速敲除.将分别含有FUT8和ST6GAL1目标导向RNAs且都能稳定表达Cas9蛋白的两个细胞株进行融合,即可获得FUT8和ST6GAL1基因都被敲除的双敲细胞株.实验结果表明,将细胞融合技术和CRISPR/Cas9技术结合可简便而快速地获得基因双敲除细胞株.

摘要： 目的 探讨玉屏风水煎剂及其组分对大鼠肾脏组织及HEK-293细胞OAT1/3表达的影响.方法 采用MTT法检测玉屏风及其组分水煎剂对HEK-293细胞存活率的影响;采用Western blot法和RT-PCR法检测各组水煎剂对大鼠肾脏及HEK-293细胞中OAT1/3蛋白及mRNA表达的影响.结果 玉屏风、白术、防风水煎剂下调大鼠肾脏和HEK-293细胞中OAT1蛋白及mRNA表达(P＜0.05,P＜0.01),玉屏风及防风水煎剂下调大鼠肾脏及HEK-293细胞中OAT3蛋白及mRNA表达(P＜0.05,P＜0.01),白术水煎剂上调大鼠肾脏及HEK-293细胞OAT3蛋白及mRNA表达(P＜0.05,P＜0.01).黄芪水煎剂对大鼠肾脏及HEK-293细胞中OAT1/3蛋白表达无抑制作用.结论 玉屏风水煎剂对OAT1/3有明显的抑制作用,玉屏风的这种抑制作用可能跟其主要成分白术、防风有关.

摘要： 目的:研究包载BTZ和PTX的纳米粒子对HEK293细胞的增殖抑制作用.方法:以HEK293细胞为实验对象,MTS方法检测BTZ、PTX、BTZ-NPs、PTX-NPs以及BTZ-PTX-NPs对HEK293细胞的增殖抑制率.用激光共聚焦显微镜观测NPS、BTZ-NPs、PTX-NPs、以及BTZ-PTX-NPs在细胞内的累积情况,观测载体材料和特定细胞器荧光染料的共定位情况.结果:BTZ、PTX、BTZ-NPs、PTX-NPs以及BTZ-PTX-NPs对体外培养的HEK293细胞均有抑制作用,抑制率呈时间及浓度依赖性,药物作用48h,NPs-PTX-BTZ浓度在0.1μg/mL左右细胞存活率高于NPs-PTX、NPs-BTZ(P＜0.05),浓度≥1 μg/mL NPs-PTX-BTZ组细胞存活率低于NPs-PTX、高于NPs-BTZ(P＜0.05).结论:浓度0.1 μg/mL左右的双药纳米粒子可以明显减轻单药对正常肾细胞造成的毒性作用.

摘要： 目的:构建SLC22A12瞬时转染HEK293细胞模型并进行鉴定.方法:构建GV142-SLC22A12重组质粒,并优化质粒转染人胚肾细胞HEK293的条件.通过qRT-PCR和Western blot检测SLC-HEK293细胞中SLC22A12 mRNA和hURAT1蛋白的表达情况,借助超高效液相色谱-串联质谱法考察尿酸钠摄取能力.结果:HindⅢ和EcoRⅠ双酶切和测序验证显示GV142-SLC22A12质粒构建成功,最佳转染条件为2μg质粒,试剂(μL):质粒(μg)=3:1.与HEK293细胞相比,SLC-HEK293细胞中SLC22A12 mRNA和hURAT1蛋白表达量上调(P<0.001);尿酸钠摄取能力更强(P<0.05).结论:成功建立了SLC22A12瞬时转染HEK293细胞模型.

摘要： 通过对不同系统表达的肿瘤标记物癌胚抗原(CEA)纳米抗体与人Fc融合蛋白(11C12-Fc)的表达、纯化及抗体性质等的比较分析,比较不同表达系统的特点及其对融合抗体性质的影响;从而为CEA融合纳米抗体在体内检测方面的应用提供理论依据.构建两种11C12-Fc表达系统(Pichia pastoris和HEK293)相应的表达载体和菌株,分别进行诱导表达、分离纯化;并对其纯化产物的生物学活性等进行初步研究.成功构建了毕赤酵母、HEK293细胞两种CEA纳米抗体融合蛋白(11C12-Fc)表达系统并实现11C12-Fc的胞外分泌表达;通过protein A柱及阴离子交换层析纯化,获得了较高纯度和浓度的11C12-Fc样品;通过突变糖基化位点的方式有效去除了毕赤酵母表达11C12的过度糖基化作用;并且其抗体亲和力较突变前未发生明显改变,与HEK293细胞表达的11C12-Fc都表现出较高的亲和力.毕赤酵母和HEK293系统均能够表达具有较高生物活性的11C12-Fc,后续的科研或生产可根据实际需要和条件来合理选择表达系统.为后续的纳米抗体融合蛋白规模化生产、体内诊断与靶向治疗的应用提供了理论和技术参考.

摘要： 目的:构建pEGFP-C1-MCH真核表达载体,并将其转染入 HEK293细胞中,筛选阳性细胞克隆,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及机制提供细胞模型. 方法:提取脑组织总RNA,反转录为cDNA,参照Genbank中提供的序列设计引物扩增MCH基因全长.再将该基因全长cDNA克隆至质粒pEGFP-C1,经菌落PCR筛选及双酶切和DNA测序鉴定,成功构建了含有目的基因MCH的重组质粒pEGFP-C1-MCH. 并利用脂质体2000介导其转染HEK293细胞,用荧光显微镜和RT-PCR检测EGFP和MCH在细胞中的表达.结果:克隆的pEGFP-C1-MCH质粒序列中的MCH与GenBank相符;细胞转染72 h后,转染成功的细胞在荧光显微镜下表达较强的绿色荧光,MCH基因稳定表达.结论:pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的稳定表达,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及作用机制提供了实验模型.

摘要： 磁性纳米粒子是一种环境友好型吸附剂,广泛应用于废水中重金属的处理.目前,有不少关于纳米粒子毒性的研究,但对处理后的纳米粒子和金属的复合物的毒性却鲜有研究.本文利用纳米四氧化三铁(MNPs)吸附水中的铬离子,以人胚胎肾细胞HEK293为生物模型,通过测定细胞活力、活性氧含量以及细胞摄取量等试验,评估磁性纳米四氧化三铁吸附六价铬后的复合产物对HEK293细胞的毒性.实验结果显示:在本实验浓度和作用时间下,Cr(VI)离子能够进入细胞,产生氧化应激,并引起细胞毒性;与Cr(VI)离子相比,磁性纳米四氧化三铁吸附Cr(VI)后的修复产物MNPs/Cr(VI)对HEK293细胞无明显毒性效应,MNPs/Cr(VI)复合物在细胞内的摄取极少,只有极少数颗粒通过内吞的方式进入细胞,且没有进入细胞核内.因此,在本实验的作用浓度和时间下,利用MNPs吸附水环境中Cr(VI)后的复合物对HEK293细胞没有明显毒性,本研究为深化了解MNPs及其重金属复合物对环境的影响提供了实验依据和参考价值.

摘要： 炎症致痛的机制已经得到广泛的证明,但是疼痛的消退原理仍未完全阐明。本研究发现,巨噬细胞表达的GPR37可能是炎症痛消退的关键因素。NPD1 (Neuroprotectin D1)及TX14可以增加GPR37转染的HEK293细胞内Ca2+水平。NPD1和TX14可激活GPR37触发巨噬细胞通过钙信号吞噬酵母聚糖颗粒。本研究通过在体实验发现小鼠后足注射pH敏感性酵母聚糖颗粒不仅诱导炎症痛、中性粒细胞和巨噬细胞的浸润,而且会导致巨噬细胞GPR37上调。巨噬细胞吞噬酵母聚糖颗粒和中性粒细胞,进而导致炎症的消退。缺失GPR37的小鼠表现出巨噬细胞吞噬功能障碍和炎症消退的延迟。而在细胞水平上,缺失GPR37基因的巨噬细胞表现出抗炎和促炎细胞因子的失调。本研究揭示了GPR37在调节巨噬细胞吞噬功能和炎症痛消退方面的作用。

摘要： 本发明先利用CVS株狂犬病病毒RABV的糖蛋白RVGP和基质蛋白RVMP自组装成的RVLPs为抗原，设计一种广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原；然后将RVGP、RVMP和EGFP共同构建到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，命名为pcDNA3.1(+)‑RVLPs‑EGFP。每个蛋白都具有独立的启动子(CMV)、核糖体结合位点(Kozak序列)和PloyA尾(PA)，以保证每个蛋白的表水平，同时利用EGFP实时监测目的蛋白的表达，构建真核重组表达质粒；而后将真核重组表达质粒转染HEK‑293细胞，细胞经扩增和传代后，进行筛选和鉴定，筛选得到稳定高效表达RVLPs的阳性单克隆细胞株HEK‑293/RVLPs。获得抗原具有哺乳动物细胞的翻译后修饰，克服了细菌、酵母、昆虫以及植物细胞来源的RVLPs由于糖基化修饰不正确而表现出低免疫原性，为RVLPs抗原的规模化生产奠定了基础。

摘要： 本发明公开了一种HEK293TS悬浮细胞的慢病毒滴度检测方法，其包括以下步骤：调整HEK293TS悬浮细胞密度并混匀；取适量HEK293TS悬浮细胞铺于24孔板中；将慢病毒液预稀释若干倍，在24孔板的每孔加入适量的预稀释病毒液，再补加适量的病毒稀释液，使各个孔内病毒液的体积相同；使用CO2摇床对HEK293TS细胞进行培养，分别培养0h、24h、48h后，分别检测0h、24h后的活细胞密度和细胞活率，并流式检测培养48h后的病毒的滴度。本发明的检测方法，操作简单，检测周期短，检测通量高，且能避免HEK293T贴壁细胞培养存在的血清批间差异问题；本发明的病毒稀释液不会造成HEK293TS悬浮细胞的细胞活率和活细胞密度的下降；本发明采用CO2摇床对病毒进行培养，提高了细胞活率、活细胞密度和FACS感染滴度。

摘要： 本发明提供一种全化学成分HEK293细胞培养基及其应用。所述培养基包括氨基酸、无机盐、维生素、微量元素、碳水化合物和有机分子。本发明的细胞培养基不含任何生长因子及其它蛋白添加物，无非化学成分界定组分；通过引入更多包括微量元素在内的组分，替代一般培养基设计中所必需的生长因子，支持HEK293细胞的高密度和高活率生长。

摘要： 本发明提供一种HEK293T细胞的驯化方法及其应用，包括一种HEK293T细胞的悬浮和无血清培养的驯化方法、所述驯化方法获得的细胞系以及所述细胞系的应用。所述驯化方法传代次数少，驯化效率高，获得的细胞活率高，分散性好，生长状态稳定，可满足商业化、规模化生产的需求。

摘要： 本发明提供了一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用，为避免慢病毒生产细胞培养过程中使用成分不明的培养基组分和动物来源的生产物料，本悬浮驯化方法流程简便，驯化时间短，成本较低；采用无血清培养基成分明确，安全风险可控，减少了工艺杂质，质量控制相对简单；生产工艺易于放大，对人力耗费较低；经扩大培养驯化所得悬浮细胞建立悬浮细胞原始细胞库(PCB)、主细胞库(MCB)、工作细胞库(WCB)，使用该悬浮系统工作细胞库(WCB)应用于慢病毒制备与生产，慢病毒粗毒液产量至少可达1‑10*107TU/mL。

摘要： 本发明公开了一种基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，包括以下步骤：S1适合慢病毒包装的HEK293T贴壁细胞的克隆筛选，筛选出侵染效率较高的前若干个克隆细胞，进行扩大培养并建库，S2对筛选的HEK293T贴壁细胞进行快速悬浮驯化，得到细胞活率93～98%，且细胞分散性较好、无明显聚集的悬浮驯化成功的HEK293T细胞；S3悬浮HEK293T高滴度慢病毒包装克隆细胞的筛选，筛选侵染效率高的病毒上清，所对应的克隆细胞即为慢病毒高产的悬浮HEK293T细胞克隆。本发明提供的基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，能快速获得生产高滴度慢病毒的悬浮HEK293T细胞克隆，所获得的悬浮HEK293T细胞克隆能无血清悬浮培养和病毒包装，病毒滴度高，纯化效率高，易于放大生产。

摘要： 本发明提供了一种HEK293细胞瞬时表达转染用试剂和瞬时表达系统转染方法，涉及基因工程技术领域，所述试剂包括穿膜肽DLR8与脂质体混合物，试剂中穿膜肽DLR8：脂质体的质量比为4～8.8:1。所述HEK293细胞瞬时表达转染用试剂和瞬时表达系统转染方法中，选择穿膜肽DLR8与脂质体混合物作为HEK293细胞瞬时表达的转染试剂，高糖DMEM培养基作为转染孵育Buffer，并在细胞转染处理后48h进行细胞悬浮，添加小分子添加剂丁酸钠，提高了HEK293细胞外源蛋白的表达水平，使得目的基因可高效表达。

摘要： 本发明公开了一种用于HEK293细胞培养及腺病毒、腺相关病毒复制扩增生产的化学成分限定培养基，由氨基酸、维生素、微量元素、无机盐及脂肪酸组成。本发明化学成分限定培养基化学要素成分明确，无血清无蛋白，也不添加植物水解物，采用了一些已知结构与功能的小分子化合物作为替代，更有利于进行HEK293细胞培养代谢及进行腺病毒、腺相关病毒的复制扩增，更加安全有效。

摘要： 本发明公开了一种GLP‑1R高表达载体及基于其的重组HEK293细胞及其构建方法和应用，利用GV358慢病毒质粒构建GV358‑GLP‑1R真核细胞表达载体，并将其转染到HEK293细胞，利用嘌呤霉素筛选得到稳转全长GLP‑1R的基因工程细胞系HEK293‑GLP‑1R，并通过Western blots实验在蛋白水平证实该细胞系可将全长GLP‑1R的蛋白表达相比于HEK293细胞提高10.96倍；且该工程细胞系HEK293‑GLP‑1R可用于降糖、减脂、改善认知功能等以GLP‑1R为靶点的药物筛选。

摘要： 本发明公开了一种EPOR高表达载体及基于其的重组HEK293细胞及构建方法和应用，属于生物技术领域。本发明利用GV492慢病毒质粒构建GV492‑EPOR真核细胞表达载体，并将其转染到HEK293细胞，利用嘌呤霉素筛选得到稳转全长EPOR的的基因工程细胞系HEK293‑EPOR，并证实该细胞系可将全长EPOR的蛋白表达提高12.65倍，EPOR高表达的细胞用于贫血、肿瘤、代谢相关疾病治疗等以EPOR为靶点的药物筛选。